Centro Regional de Análisis de Recursos y Medio Ambiente. Universidad Austral de Chile. 2

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1 3.1 DISTRIBUCIÓN DE QUISTES DE Alexandrium catenella Y Protoceratium reticulatum (Dinoflagelados) EN SEDIMENTOS PROVENIENTES DE LA REGIÓN DE LOS LAGOS (41º 25-43º 08 Lat. S). (CONA-C11F 05-17) Miriam Seguel 1*, Andrea Sfeir 1 & Marcia Gangas 2 1 Centro Regional de Análisis de Recursos y Medio Ambiente. Universidad Austral de Chile. 2 Escuela de Ingeniería en Acuicultura, Universidad Austral de Chile. Puerto Montt. mseguel@uach.cl 1* ; asfeir@uach.cl INTRODUCCIÓN Las Floraciones Algales Nocivas son eventos recurrentes en el sur de Chile. Una de las características de los dinoflagelados tóxicos es la producción de quistes de resistencia como resultado de la reproducción sexual, los cuales cumplen un rol ecológico importante en la iniciación y dispersión de las floraciones (Fukuyo, 2003). Por lo tanto, se hace de gran necesidad conocer la distribución espacial y abundancia de estos quistes con especial énfasis en las áreas geográficas utilizadas para la acuicultura. El primer estudio de distribución espacial de quistes de dinoflagelados en la región de Los Lagos se realizó en el año 2004 y corresponde al proyecto Distribución de quistes de Alexandrium catenella y de otros dinoflagelados en la zona comprendida entre Puerto Montt y la boca del Guafo, financiado por el Comité Oceanográfico Nacional. En este proyecto se eligieron un total de 18 estaciones, distribuidas a lo largo de toda la región de manera de cubrir desde el seno Reloncaví hasta Quellón en la isla Chiloé. Los resultados indicaron la presencia de quistes de Alexandrium catenella en siete estaciones (estero Reñihue, estero Castro, isla Lemuy, bahía Corcovado, canal Chiguao, estero Huildad y bahía Tictoc), todas ubicadas al sur del paralelo 42º 35, coincidiendo con la distribución de esta especie durante el evento tóxico del año Otro resultado de gran interés de este proyecto fue la presencia de quistes de Protoceratium reticulatum, dinoflagelado productor de yesotoxinas (Satake et al., 1997), uno de los componentes de las toxinas liposolubles. Los quistes de Protoceratium reticulatum son de tamaño pequeño a mediano, esféricos a subesféricos, los procesos son delgados, huecos y capitados, con un diámetro que varía entre los 35 a 45 mm. La pared celular tiene procesos de longitud variable. Estos quistes se encontraron en las muestras provenientes del estuario Reloncaví, Tictoc y Quinchao entre otras. La concentración máxima fue de 15 quistes/cc en el sector de Puelo. De acuerdo a estos antecedentes, el objetivo principal de este trabajo es conocer la distribución geográfica de quistes de Alexandrium catenella desde Dalcahue hacia el sur en la isla Chiloé y de Protoceratium reticulatum en el estuario Reloncaví y 51

2 Crucero CIMAR 11 el fiordo Comau. El segundo objetivo específico es determinar la presencia de toxinas diarreica paralizante y amnésica en el estuario Reloncaví y en el fiordo Comau. MATERIALES Y MÉTODOS Para dar cumplimiento al objetivo principal de este proyecto se intensificó el muestreo en las áreas que se encontraron quistes de Alexandrium catenella y Protoceratium reticulatum durante el Crucero CIMAR 10 Fiordos, para ello se eligieron 10 estaciones ubicadas de Dalcahue hacia el sur y 5 estaciones ubicadas en el estuario Reloncaví y en el fiordo Comau. Los sedimentos fueron obtenidos en los meses de julio y noviembre de 2005 durante el crucero CIMAR 11 Fiordos. Se tomaron muestras en bahías protegidas, a profundidades que variaron entre 1 y 20 metros. En cada estación, se tomaron dos tipos de muestras de sedimento, en la primera el buzo arrastró un frasco plástico de 80 cc por el fondo, cuidando de tomar los primeros tres centímetros del sedimento y la segunda muestra se obtuvo enterrando un core de 8 cm de largo por 3 cm de diámetro. Cada muestra tiene una réplica, la cual fue tomada a una distancia de 50 m. A bordo, tanto los frascos como los cores se envolvieron con papel de aluminio y se guardaron en cajas de aislapol refrigeradas con gelpack. En el laboratorio, los sedimentos fueron sonicados utilizando un sonicador Labsonic 1000 L/Broun Sonic y tamizados de acuerdo al protocolo descrito por Matsuoka & Fukuyo (2000). En ambos tipos de muestras, se contó el número de quistes de Alexandrium catenella, Protoceratium reticulatum y otros dinoflagelados presentes, en tres alicuotas de 1 ml utilizando cámaras Sedgewich Rafter bajo un microscopio compuesto de contraste de fase Olympus. En el caso de las muestras tomadas con jeringa se analizaron dos estratos: el primero abarcó los primeros tres centímetros y el segundo del cuarto al sexto centímetro. Los resultados se entregan en Nº quistes ml 1. En seis estaciones ubicadas principalmente en el estuario Reloncaví y fiordo Comau se recolectaron al menos dos especies de mariscos de importancia comercial (Cholgas, chorito, choro zapato o loco) para el análisis de toxinas paralizante (VPM), diarreica (VDM) y amnésica (VAM). A bordo, los moluscos fueron desconchados y congelados para su posterior análisis en el laboratorio. La metodología utilizada para la determinación de veneno paralizante de los mariscos es el bioensayo de ratón descrita por la A.O.A.C y por Cromatografía Líquida de alta Resolución (Franco & Reyero, 1995). El grupo de las toxinas diarreicas, actualmente denominadas lipofílicas, se detectó mediante el bioensayo de ratón de Yasumoto, 1984 (Fernández et al., 2002). La toxina amnésica fue detectada por (HPLC) por el método de Quilliam et al. (1995). RESULTADOS Quistes de dinoflagelados en sedimentos Se analizaron un total de 75 muestras de sedimentos, de las cuales 30 corresponden a core y 45 a frascos, recolectados de 15 estaciones. Los análisis tanto de los cores como de los frascos arrojaron resultados similares, presencia de quistes de Alexandrium catenella en Quellón y en Chiguao (Fig. 1). Se encontraron en Quellón un promedio de 7,4 quistes ml 1 en el estrato 1-3 cm y 4,7 quistes ml 1 en el estrato 4-52

3 6; en Chiguao 2,7 quistes ml 1 en el estrato 1-3 cm y 5,3 quistes ml -1 en el estrato 4-6 cm. Estos resultados contrastan con los encontrados en el año 2004, donde la distribución geográfica de los quistes fue más amplia, estero Castro, isla Lemuy, estero Huildad y canal Chiguao (Seguel et al., 2005). Las mayores concentraciones fueron en Chiguao con un valor promedio de 23,6 quistes ml 1 en el estrato 1-3 cm en el 2004 (Seguel et al., 2005) y de 127 quistes ml 1 en Yenecura (Fernández et al., 2005). Los quistes de Protoceratium reticulatum se encontraron en las tres estaciones del estuario Reloncaví (Petrohué (7), Puelo (6) y en la boca del estuario (4)) y en Chiguao en la isla Chiloé (Fig. 1). La concentración fue baja en todas estaciones. En Petrohué fue de 2 quistes ml 1 en el estrato 1-3 cm y de 3,4 quistes ml 1 en 4-6 cm, en la boca del estuario fue de 2,7 quistes ml 1 en ambos estratos y en Puelo de 1,7 quistes ml 1. En Chiguao fue de 0,7 quistes ml 1 en el estrato de 1-3 cm y de 4,8 quistes ml 1 en el de 4-6 cm. Además, se cuantificaron quistes vacíos, los cuales se encontraron en altas concentraciones en Petrohué (20,9 quistes ml 1 ) y en Puelo (33,3 quistes ml 1 ). Esta distribución geográfica concuerda con la información obtenida durante el muestreo de 2004, estuario Reloncaví y Quinchao. La única diferencia radica en las concentraciones, el valor máximo fue de 15 quistes/cc en el sector de Puelo (Seguel et al., 2005). Análisis Toxicológico en moluscos de importancia comercial Se analizaron un total de 23 muestras (chorito, cholga y loco) para toxinas paralizante provenientes de seis estaciones, ubicadas principalmente en el sector del estuario Reloncaví y en fiordo Comau. El bioensayo de ratón no detectó la toxina paralizante en ninguno de los recursos analizados tanto en invierno como en primavera. Sin embargo, los análisis realizados por HPLC detectaron la presencia de: Saxitoxina, Neosaxitoxina, de saxitoxina, GTX2-3 y 4 en niveles menores a 5 µg de STX eq. 100 g 1, muy inferiores al límite de detección del bioensayo de ratón que es de 30 µg de STX eq. 100 g 1 (Fig. 2). La fuente de estas toxinas en nuestro país ha sido atribuida a Alexandrium catenella. Sin embargo, esta especie no ha sido detectada en el estuario Reloncaví. En relación a las toxinas lipofílicas se encontraron 7 muestras positivas de un total de 19, las cuales corresponden a mitílidos provenientes del estuario Reloncaví y del islote Ica tanto en invierno como en primavera (Fig. 2). Análisis realizados por el Servicio de Salud Llanchipal, durante este mismo período, determinaron igualmente la presencia de toxinas lipofílicas, las cuales fueron analizadas separando ácido okadaico, dinofisistoxinas y pectenotoxinas de yesotoxina. Este estudio determinó la presencia de yesotoxina en niveles por debajo de los establecidos en la Decisión 2002/225/CE del 15 de marzo de La toxina amnésica se encontró en la mayoría de los recursos analizados en primavera, con un valor máximo de 2,18 µg g -1 en la cholga proveniente del estuario Reloncaví. En invierno, estuvo ausente en el área de estudio. Esta toxina está ampliamente distribuida en la región con valores máximos en primavera-verano. En diciembre de 2004 se detectan niveles de 18 µg g 1 y en diciembre de 2005 de 6 µg g 1 en las islas Butachauques (proyecto FDI-CORFO CT-02), incluso SERNAPESCA cierra el 53

4 Crucero CIMAR 11 sector de Calbuco por concentraciones superiores a 5 µg g 1 de carne durante el verano de 2005 y CONCLUSIONES 1. Los quistes de Alexandrium catenella están restringidos al sector sur de la isla Chiloé, Quellón y Chiguao. La concentración máxima fue de 7,4 quistes ml La presencia de quistes de Protoceratium reticulatum en el estuario Reloncaví nos hace presumir que este dinoflagelado sería la posible fuente de yesotoxinas encontradas en los mariscos. 3. Este es el primer registro de toxina paralizante en los mariscos provenientes del estuario Reloncaví. Este grupo de toxinas se encontró en niveles muy por debajo del límite de detección del bioensayo de ratón. Esto nos lleva a pensar en la posibilidad de que hayan ocurrido eventos tóxicos de baja magnitud, sin quedar un registro de ellos. 4. Se detectó toxina amnésica en los moluscos provenientes del estuario Reloncaví y del fiordo Comau durante la primavera. El valor máximo fue de 2,18 µg g 1, nivel que está por debajo del límite permisible para el consumo humano (20 µg g 1 ). AGRADECIMIENTOS Los autores agradecen al Comité Oceanográfico Nacional por el financiamiento de este Proyecto, a la tripulación del buque AGOR Vidal Gormaz y a los buzos Francisco Gallardo y Jorge Muñoz por su indispensable labor en el cumplimiento de los objetivos de este proyecto. REFERENCIAS A.O.A.C Official Methods of Analysis cap. 49, pp MATSUOKA, K. & Y. FUKUYO, Guía Técnica para el Estudio de Quistes de Dinoflagelados Actuales. WESTPAC-HAB/WESTPAC/IOC. 30 pags + plates. FERNÁNDEZ, M. L., A. MÍGUEZ, E. CACHO, A. MARTÍNEZ, J. DIOGÉNE & T. YASUMOTO Bioensayos con mamíferos y ensayos bioquímicos y celulares para la detección de ficotoxinas. En: Floraciones Algales Nocivas en el Cono Sur Americano (Sar, E. et al., eds). Instituto Español de Oceanografía, pp FERNÁNDEZ, P., P. LEAL, C. ALVES, G. PIZARRO & D. VARELA Distribución y abundancia de quistes modernos de dinoflagelados en aguas interiores de la 54

5 zona austral de Chile (48º 08 S y 54º 55 S) con énfasis en Alexandrium catenella (Whedon & Kofoid) Balech. XI Congreso Latinoamericano de Ciencias del Mar COLACMAR y XXV Congreso de Ciencias del Mar. Libro de Resúmenes, pág FRANCO, J. M. & M. I. REYERO, Determinación de toxinas PSP. Comparación entre la oxidación química y la electroquímica. En: Proceeding of IV Reunión Ibérica sobre Fitoplancton Tóxico y Biotoxinas, Matamoros E.& Delgado M., (Eds.). (Dirección General de Pesca Marítima, Barcelona), pp FUKUYO, Y Red Tide Species and the Environmental Conditions: Alexandrium. En: Red Tides (Okaichi, T. ed. ). Terra Scientific Publishing Company, Tokio QUILLIAM, M. A., M. XIE & W. R. HARDSTAF Rapid extraction and clean up for liquid chromatographic determination of domoic acid in unsalted seafood. J.A.O.A.C. Int., 78,2, SATAKE, M., L. MACKENZIE & T. YASUMOTO Identification of Protoceratium reticulatum as the biogenic origin of yessotoxin. Nat. Toxins 7: SEGUEL, M., A. SFEIR & V. ALVORNOZ Distribución de quistes de Alexandrium catenella y Protoceratium reticulatum en la zona comprendida entre Puerto Montt y boca del Guafo. Informes Preliminares. Crucero CIMAR 10 Fiordos, pp

6 Crucero CIMAR S 43 A. catenella P. reticulatum O c é a n o P a c í f i c o Golfo de Ancud DQ1 20 DH1 CL2 DQ4 CL4 CL6 CQ1 QL4 QL3 QL6 Golfo Corcovado HC8 Boca del Guafo Ba. Tictoc W Figura 1: Distribución de los quistes Alexandrium catenella y Protoceratium reticulatum en los sedimentos de la Décima Región. 56

7 VPM - HPLC 6 42 S 43 VDM VAM O c é a n o P a c í f i c o Golfo de Ancud Golfo Corcovado HC8 Boca del Guafo Ba. Tictoc W Figura 2: Distribución de toxinas marinas encontradas en el Crucero CIMAR 11 Fiordos. 57