CITOMEGALOVIRUS IgM EIA WELL REF K4CM. Español. M171.es Rev.09 02/2006
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- Eva Gómez Zúñiga
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1 0123 CITOMEGALOVIRUS IgM EIA WELL REF K4CM 96 Español M171.es Rev.09 02/2006
2 REACTIVOS DEL KIT REACTIVOS CANTIDAD ESTADO FÍSICO MTP 1 x 96 Listo para usar WASH 1 x 50 ml Concentrada DIL 1 x 100 ml Listo para usar NEG 1 x 2 ml Listo para usar POS 1 x 2 ml Listo para usar C/O 1 x 2 ml Listo para usar Ag 7 x 2.5 ml Liofilizado CONJ BIO 1 x 19 ml Listo para usar CONJ 1 x 14 ml Listo para usar TMB 2 x 15 ml Listo para usar STOP 1 x 14 ml Listo para usar M171.es Rev.09 02/2006 Pag. 2/12
3 ENSAYO INMUNOENZIMÁTICO PARA LA DETERMINACIÓN CUALITATIVA Y/O CUANTITATIVA DE LOS ANTICUERPOS IgM ANTI-CITOMEGALOVIRUS EN SUERO O PLASMA HUMANO PARA USO DIAGNÓSTICO IN VITRO 1. APLICACIONES CLÍNICAS El citomegalovirus (CMV) es un virus de estructura icosaédrica con un diámetro de nm, perteneciente a la familia de los Herpes virus. El virus tiene efectos citopatológicos con engrosamiento de las células huespedes con inclusiones citoplasmáticas y nucleares. El CMV está considerado como uno de los factores biológicos más importantes causantes de anomalias congénitas como consecuencia de infecciones imtrauterinas. Aproximadamente el 2% de las mujeres embarazadas contraen una infección primaria o una reinfección, mientras el 10 20% de los neonatos con infecciones congénitas causadas por CMV presentan daños significativos en el sistema nervioso central. Estas infecciones congénitas pueden ser también provocadas por una reactivación endógena del virus en la madre. Recientemente se está dando notable importancia al CMV como causa de complicaciones en el transplante de órganos, especialmente de riñón. La incidencia de infecciones por CMV tras un transplante renal de un sujeto CMV positivo a uno CMV negativo se ha estimado alrededor del %. La infección por CMV está muy difundida: anticuerpos anti-cmv se han encontrado en el 50 70% de los individuos de más de 35 años. Por otra parte el CMV ha podido aislarse en la cérvix uterina del 10% de las mujeres sanas. La infección por CMV más difundida es normalmente asintomática. Tras una infección primaria por CMV, los anticuerpos IgM, en individuos inmunocompetentes, persisten entre 2 a 9 meses. En los pacientes sometidos a transplantes o inmunodeprimidos, los anticuerpos IgM pueden persistir en el organismo durante más de 2 años. 2. PRINCIPIO DEL MÉTODO El presente kit se basa en el método inmunoenzimático (ELISA) y más precisamente es un método inmuenozimático de tipo captura para la determinación cualitativa de las IgM específicas anti-cmv. Durante la primera incubación los anticuerpos anti-cmv de la clase IgM eventualmente presentes en el suero, son capturados por los anticuerpos anti cadenas µ de las IgM humanas, adheridos a la superficie de los pocillos. El material que no se haya unido se elimina mediante lavado. En dos sucesivas incubaciones se hace reaccionar una mezcla de antígeno CMV-anticuerpo monoclonal anti-cmv biotilinado y streptavidina-hrpo con el complejo ya formado entre IgM específicas anti-cmv y anticuerpos anti cadenas µ. Tras un nuevo lavado se añade la tetrametilbencidina (TMB) incolora que, al reaccionar con la peroxidasa presente, produce un compuesto coloreado. La reacción de desarrollo de color se para añadiendo H 2 SO 4 y la intensidad del color, medida en un espectrofotómetro a 450 nm y a 405 nm, es directamente proporcional a la concentración de anticuerpos IgM anti- CMV presentes en las muestras y controles. 3. REACTIVOS SUMINISTRADOS CON EL KIT: PREPARACIÓN Y ESTABILIDAD Los reactivos son suficientes para 96 pocillos. El kit debe conservarse a 2-8 C. La fecha de caducidad de cada reactivo está indicada en su etiqueta. Una vez abierto el kit es estable 2 meses a 2-8 C. M171.es Rev.09 02/2006 Pag. 3/12
4 3.1 Reactivos específicos MTP Microplaca sensibilizada: 1 microplaca de 96 pocillos divisibles individualmente, sensibilizados con anticuerpo monoclonales anti-igm umanas. Los pocillos no utilizados deben conservarse a 2-8 C en la bolsa de plástico suministrada, cerrada herméticamente. POS Control Positivo: 1 vial (2 ml) de matriz sérica reactiva a las IgM anti CMV. Conservante NaN 3 (<0,1%). Lista para usar. C/O Control Cut-Off: 1 vial (2 ml) de matriz sérica reactiva a las IgM anti CMV. Conservante NaN 3 (<0,1%). Lista para usar y coloreado de azul. Ag Antígeno CMV: 7 viales con Antígeno CMV, liofilizado. En el momento del uso reconstituya cada vial con 2.5 ml de Conjugato Biotilinado. El reactivo reconstituido es estable 3 días si conservado a 2-8 C y 1 mes a -20 C (no congelar más de una vez). CONJ BIO Conjugado Biotilinado: 1 vial (19 ml) de anticuerpos monocolonales anti-cmv conjugados con biotina. Conservante: Neomicina. Listo para usar. CONJ Conjugado Enzimático: 1 vial (14 ml) de streptavidina conjugada con peroxidasa de rábano (HRPO) en matriz sérica y estabilizantes. Conservante: Neomicina. Listo para el uso. 3.2 Reactivos Comunes para los kits de la Línea To.R.C.H. E.T.S. y Enfermedades de la infancia. WASH Solución de Lavado (concentrada): 1 vial (50 ml) de PBS-Tween 20. Conservante: Mertiolato (<0.05%). En el momento del uso diluya la cantidad necesaria 1:20 con H 2 O destilada. Si se observan cristales insolubles, resuspénderlos poniendo el vial a 37 C durante algunos minutos. Tras la dilución el tampón de lavado es estable 30 días a 2-8 C. DIL Diluyente de las Muestras (concentrado): 1 vial (100 ml) de PBS y estabilizantes. Listo para usar y coloreado de rojo. Conservante: NaN 3 (<0.1%). NEG TMB STOP Control Negativo: 1 vial (2 ml) de matriz sérica no reactiva a las IgM anti-cmv. Conservante: NaN 3 (<0.1%). Listo para el uso y coloreado de rojo. Cromógeno: Tetrametilbencidina (TMB) en tampón de citrato-fosfato, DMSO y H 2 O 2.. Listo para el uso. Reactivo de Parada: 1 (14 ml) de H 2 SO 4 1N. Listo para usar. CPA Cubreplaca adhesivo. Bolsa de plástico con cierre. 4. MATERIAL NECESARIO NO SUMINISTRADO 4.1 Ensayo manual Micropipetas automáticas con puntas desechables de volumen variable. Incubador a 37±2 C. Cilindros graduados para la dilución de los reactivos. Bomba de aspiración o instrumento automático de lavado de microplaca. Espectrofotómetro de precisión para microplacas, capaz de medir la absorbancia en el intervalo A con una longitud de onda de 450 y 405 nm. H 2 O destilada. M171.es Rev.09 02/2006 Pag. 4/12
5 4.2 Ensayo automático El kit puede utilizarse con instrumentación automática para kits ELISA en microplaca. Se garantiza la aplicabilidad en instrumentación RADIM y/o SEAC. En el caso se utilice instrumentación automática de otros fabricantes, es responsabilidad del usuario asegurarse de que el kit haya sido oportunamente validado. 5. ADVERTENCIAS Y PRECAUCIONES Para conseguir resultados correctos y reproducibles, deberán observarse las siguientes normas: No mezclar los reactivos específicos (vea 3.1) de lotes diferentes. Es posible utilizar reactivos comunes (vea 3.2) de lotes diferentes. No utilizar los reactivos después de la fecha de caducidad. No exponer los reactivos y las muestras al calor intenso ni a fuentes importantes de contaminación. Utilizar material de vidrio perfectamente limpio y libre de contaminación por iones metálicos o sustancias oxidantes. Utilizar agua destilada o desionizada, conservada en recipientes perfectamente limpios. Evitar cuidadosamente la contaminación entre muestras; para ello es aconsejable utilizar pipetas con puntas desechables para cada muestra y reactivo. No modificar el Procedimiento Operativo de ejecución del ensayo. Eventuales alteraciones de: secuencia y cantidades al añadir los reactivos tiempos y temperatura de incubación pueden dar lugar a resultados clínicos erróneos. Reconstituir los reactivos liofilizados según la modalidad descrita en la etiqueta; la utilización de reactivos o volúmenes no adecuados puede provocar la obtención de datos clínicos incorrectos. En el caso de procedimiento manual es importante utilizar pipetas calibradas y tener una adecuada manualidad técnica. En particular es importante la precisión en la preparación y dispensación de los reactivos. Es necesario un adecuado mantenimiento (limpieza y calibración) de tales instrumentos. Asegurarse de que la bomba de aspiración o el sistema automático para el lavado de las microplacas funcione correctamente. El lavado inadecuado de las microplacas puede causar la clasificación incorrecta de las muestras. Es necesario un mantenimiento adecuado de tales sistemas. Asegurarse de que el espectrofotómetro funcione perfectamente. El uso de un espectrofotómetro no calibrado o con filtros no limpios puede causar una lectura errónea de las muestras, con consiguiente error en su clasificación. Es necesario un adecuado mantenimiento (limpieza y calibración) de tales instrumentos. Asegurarse de que el incubador (si es necesario) funcione perfectamente. La incubación a temperaturas distintas a los 37±2º puede causar una pérdida de sensibilidad y/o desnaturación biológica de los materiales (muestras y/o reactivos). Es necesario un adecuado mantenimiento de tales instrumentos y un control periódico de la temperatura registrada. Asegurarse de que el agitador de microplacas (si es necesario) funcione perfectamente. La agitación incorrecta puede causar la clasificación errónea de las muestras. Es necesario un adecuado mantenimiento de tales instrumentos. Asegurarse de que los sistemas utilizados para la conservación de las muestras y/o el dispositivo funcione perfectamente. La conservación a temperaturas diferentes de la M171.es Rev.09 02/2006 Pag. 5/12
6 indicada puede causar la desnaturación biológica de los materiales (muestras y/o reactivos). Es necesario un adecuado mantenimiento de tales sistemas y un control periódico de la temperatura registrada. Utilizar un método adecuado para la correcta identificación de las muestras de los pacientes. Una identificación incorrecta puede provocar pérdida de la especificidad del sistema y resultados clínicos erróneos. Para evitar contaminaciones personales y ambientales, deberán observarse las siguientes normas de seguridad: Utilizar guantes desechables durante la manipulación del material potencialmente infeccioso y durante el ensayo. No pipetear los reactivos con la boca. No fumar, comer, beber o aplicar cosméticos durante la ejecución del ensayo. Las soluciones de Cromógeno y el Reactivo de Parada deben manipularse con cuidado. Evitar el contacto con la piel, los ojos y las mucosas. En caso de contaco lavar con abundante agua. Todos los materiales humanos suministrados con el kit han sido sometidos a análisis resultando negativos a la presencia de HBsAg, anti-hiv y anti-hcv. Sin embargo, los ensayos mencionados no garantizan la total ausencia de los agentes vírales responsables del síndrome de inmunodeficiencia adquirida y de la hepatitis B y C. Por eso todos los reactivos contenentes material biológico y todas las muestras deben considerarse potencialmente infecciosos. Evitar salpicaduras y formación de aerosoles; en caso de que se presenten, limpiar cuidadosamente con hipoclorito sódico a una concentración final de 3%. Todo el material utilizado para la limpieza debe tratarse como residuo potencialmente infeccioso y desecharse según las oportunas modalidades. La azida sódica, contenida como conservante en algunos reactivos, puede reaccionar con el plomo y el cobre de los desagües formando azidas metálicas altamente explosivas. Para evitar la formación y la acumulación de dichos compuestos deje correr abundantemente el agua al eliminar los reactivos. Los reactivos para los que no se suministra la ficha de seguridad no contienen sustancias químicas peligrosas o, si las contienen, están por debajo de los límites de concentración definidos en el D.Lgs.285/98 conforme a la directiva CEE 91/155. Conforme al Decreto Italiano D.L. no. 22, del y conforme a las directivas de la CEE (91/156/CEE, 91/689/CEE, 94/62/CEE), todos los desechos originados por procesos manuales y/o automáticos se clasifican como material de deshecho peligroso, código de Clasificación CER : como tales, deben eliminarse delegando su recolección y desecho a empresas especiales autorizadas para ello. 6. RECOLECCIÓN Y PREPARACIÓN DE LAS MUESTRAS El ensayo puede realizarse en muestras de suero o plasma humanos. Las muestras moderadamente lipémicas no afectan los resultados; las muestras extremadamente lipémicas o hemolizadas pueden alterar los resultados. La presencia de filamentos de fibrina podría interferir en el ensayo; asegurarse por lo tanto de que las muestras estén perfectamente limpias antes de ensayarlas. Las muestras pueden conservarse a 2-8 C durante 1 semana; para períodos más largos se recomienda conservar las muestras a -20 C. Se aconseja no congelar y descongelar repetidamente las muestras. Antes de su uso, diluir las muestras 1:100 con el diluyente de las muestras (ejemplo: 10 µl de muestra µl de diluyente). M171.es Rev.09 02/2006 Pag. 6/12
7 7. PROCEDIMIENTO OPERATIVO* Esperar que los reactivos y las muestras alcancen la temperatura ambiente. Agitar las muestras por inversión antes de utilizarlas. 7.1 Preparar los pocillos para el Blanco, el Suero de Control y las muestras. 7.2 Dispensar 100 µl de Suero de Control y muestras ya diluidas en los respectivos pocillos. Nota: el Suero de Control no debe diluirse. 7.3 Dispensar 100 µl de Diluyente de las Muestras en el pocillo del blanco. 7.4 Incubar durante 60±5 minutos a 37±2 C cubriendo la microplaca con la hoja adhesiva suministrada con el kit. 7.5 Lavar los pocillos 4 veces con 350 µl (por pocillo) de solución de lavado diluida. Aspirar completamente el líquido de todos los pocillos. 7.6 Dispensar 100 µl de Antígeno reconstituido con el Conjugado Biotilinado en todos los pocillos. 7.7 Incubar durante 60±5 minutos a 37±2 C cubriendo la microplaca con la hoja adhesiva suministrada con el kit. 7.8 Lavar los pocillos como en el punto Dispensar 100 µl de Conjugado Enzimático en todos los pocillos Incubar durante 30±2 minutos a 37±2 C cubriendo la microplaca con la hoja adhesiva suministrada con el kit Lavar los pocillos como en el punto Dispensar 100 µl de Cromogeno en todos los pocillos Incubar durante 20±2 minutos a 37±2 C al resguardo de la luz Dispensar 100 µl de Reactivo de Parada en todos los pocillos Leer la densidad óptica a 450 nm, preferiblemente en un espectrofotómetro bicromático con longitud de onda de referencia de 620 nm (haciendo el cero del instrumento con el blanco). En el caso de lectura fuera del rango (overflow), leer a 405 nm. Leer en los primeros 15 minutos después de terminar el ensayo. *En caso de que se utilice en el procedimiento un sistema automático RADIM y/o SEAC para microplacas, ver el manual correspondiente. 8. ESQUEMA DEL ENSAYO: Ver pág CÁLCULO DE LOS RESULTADOS * Considerar la densidad óptica del control negativo, del control Cut-off y del control positivo. Comparando la densidad óptica de las muestras con la densidad óptica del control Cut-off (valor umbral) se determina la reactividad o no reactividad ante los anticuerpos IgM anti- CMV. Las muestras con valores de densidad óptica inferiores al valor del control Cut-off deben considerarse no reactivas ante los anticuerpos IgM anti-cmv. Las muestras con valores de densidad óptica superiores al valor del control Cut-off deben considerarse reactivas ante los anticuerpos IgM anti-cmv. Las muestras con valores de densidad óptica comprendidos en el intervalo de ± 10% del control Cut-off, deben considerarse de interpretación dudosas y deben volverse a ensayar. * En el caso de que se utilice el sistema automático RADIM y/o SEAC para microplacas, la lectura espectrofotométrica se realiza automáticamente con 3 longitudes de onda: 450, 405 y 620 nm, permitiendo la ampliación del rango de lectura. M171.es Rev.09 02/2006 Pag. 7/12
8 9.1 Ejemplo de cálculo Los valores siguientes deben considerarse únicamente como un ejemplo y no deben emplearse en lugar de los datos experimentales. Descripción Absorbancia IgM anti-cmv Índice Control Negativo Control Cut-off Control Positivo Muestra Las muestras ensayada es positiva a los anticuerpos IgM anti-cmv. 9.2 Criterios de aceptación Antes de proceder al cálculo de los resultados, verificar que las absorbancias de los controles respeten los siguientes valores: Descripción D.O 450 nm Control Negativo < Control Cut-Off > Control Positivo > Si los valores obtenidos no concuerdan con los esperados, es necesario repetir el ensayo. 9.3 Interpretación de los resultados Las muestras con valores de densidad óptica inferiores al valor del control Cut-off (Índice <1.0) deben considerarse negativas ante los IgM anti-cmv. Las muestras con valores de densidad óptica superiores al valor del control Cut-off (Índice >1.0) deben considerarse positivas ante los IgM anti-cmv. Las muestras con valores de densidad óptica comprendidos en el intervalo de ± 10% del control Cut-off (Índice ), deben considerarse de interpretación dudosas; se aconseja volver a ensayar las muestras. CARACTERÍSTICAS METODOLÓGICAS 10.1 Especificidad Diagnóstica El presente método no ha presentado interferencias debidas al factor reumatoide, ni a la presencia de IgM dirigidas ante otros virus herpéticos (EBV, HSV, Varicela). La especificidad diagnóstica del método se ha evaluado con un grupo de 236 muestras negativas a las IgM anti-cmv, resultando igual al 100% Sensibilidad Diagnóstica La sensibilidad diagnóstica del método se ha valorado con un grupo de 61 muestras con infecciones agudas de CMV, resultando igual al 93.4% Especificidad Analítica La especificidad analítica, se define como la capacidad del ensayo de revelar exactamente el analito en presencia de factores potencialmente interferentes en la matriz de la muestra. Estudios controlados sobre factores potencialmente interferentes han demostrado que las prestaciones del ensayo no se ven influenciadas por anticoagulantes (EDTA y heparina). M171.es Rev.09 02/2006 Pag. 8/12
9 10.4 Precisión La precisión ha sido evaluada en un analizador RADIM midiendo la repetitividad y la reproducibilidad (variabilidad intra-ensay e inter-ensayo) en 3 sueros con distintas concentraciones de anti-cmv IgM. Repetitividad (Intra-ensayo) Suero Media ± D.S. C.V. Replicados (S/CO) % n. a 11.7 ± b 4 ± c 1.9 ± Reproducibilidad (Inter-ensayo) Suero Media ± D.S. C.V. Ensayos (S/CO) % n. a ± b 2.18 ± c 1.57 ± LÍMITES DEL ENSAYO Debe tenerse en cuenta que, para definir el estado inmunitario de un paciente con relación al CMV, la presencia de anticuerpos de tipo IgG a cualquier nivel no excluye la posibilidad de una infección en curso, mientras los anticuerpos específicos de tipo IgM se encuentran tanto en infecciones primarias como en reactivaciones. En infecciones primarias por CMV de sujetos inmunocompetentes, los anticuerpos IgM pueden persistir durante varios meses, mientras en casos de inmunodepresión los anticuerpos IgM se pueden detectar durante más de un año tras la infección primaria o la reactivación. 12. LEYENDA DE SÍMBOLOS: vea p. 10 SÍMBOLOS M171.es Rev.09 02/2006 Pag. 9/12
10 EN 980 EDMA REF Código de referencia o número de pedido LOT Lote Fecha de caducidad IVD Para uso diagnóstico in vitro Marcado CE según directiva de IVD 98/79 CE Conservar a 2-8 C Producido por Riesgo biológico Consultar las instrucciones de uso 96 Suficiente para 96 determinaciones RDATE Fecha de referencia RCNS Reconstituir con H 2 O Agua destilada o desionizada M171.es Rev.09 02/2006 Pag. 10/12
11 BIBLIOGRAFÍA 1 - Ahlfors K. (1982). Epidemiological studies of congenital cytomegalovirus infection. Scand. J. Inf. Dis. suppl Ho M. (1977). Virus infections after trasplantation in man - A brief review. Arch. Cirol. 55, Stern H., Turker S.M. (1973). Prospective study of cytomegalovirus infection in pregnancy. Br. med. J., 2, Pass R.F., Griffith P.D., August A.M. (1983). Antibody Response to cytomegalovirus after Renal Transplanation: Comparison of Patients with Recurrent infections. J. Inf. Dis., 147, M171.es Rev.09 02/2006 Pag. 11/12
12 ESQUEMA DEL ENSAYO Predilución de la muestra: 1/100 Pocillos Blanco NEG C/O POS Muestras Reactivos NEG µl C/O µl POS µl Muestras µl DIL 100 µl Incubar a 37 ±2 C, 60'±5' Aspirar y Lavar: 4 x 350 µl. Ag CONJ BIO 100 µl 100 µl 100 µl 100 µl 100 µl Incubar a 37 ±2 C, 60'±5' Aspirar y lavar: 4 x 350 µl CONJ 100 µl 100 µl 100 µl 100 µl 100 µl Incubar a 37 ±2 C, 30'±2' Aspirar y lavar: 4 x 350 µl. TMB 100 µl 100 µl 100 µl 100 µl 100 µl Incubar a 37 C±2 C, 20'±2' STOP 100 µl 100 µl 100 µl 100 µl 100 µl Leer a nm. RADIM S.p.A. - Via del Mare, Pomezia (Roma) Italia Tel.: Fax: National Order Entry: Export Department: Customer Care: info@radim.it -
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