CITOMEGALOVIRUS IgG EIA WELL REF K3CG REF K3CGB. Español. M44.es Rev.13 07/2008

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1 0123 CITOMEGALOVIRUS IgG EIA WELL REF K3CG 96 REF K3CGB 192 Español M44.es Rev.13 07/2008

2 REACTIVOS DEL KIT REACTIVOS CANTIDAD ESTADO FÍSICO K1TG K1TGB MTP 1 x 96 1 x 192 Listo para usar WASH 1 x 50 ml 2 x 50 ml Concentrada DIL 1 x 20 ml 2 x 20 ml Concentrado NEG 1 x 2 ml 1 x 2 ml Listo para usar CAL 1 x 2.5 ml 4 x 1.5 ml 1 x 2.5 ml 4 x 1.5 ml Listo para usar CONJ 1 x 14 ml 2 x 14 ml Listo para usar TMB 2 x 15 ml 2 x 15 ml Listo para usar STOP 1 x 14 ml 2 x 14 ml Listo para usar M44.es Rev.13 07/2008 Pag. 2/12

3 ENSAYO INMUNOENZIMÁTICO PARA LA DETERMINACIÓN CUALITATIVA Y/O CUANTITATIVA DE LOS ANTICUERPOS IgG ANTI-CITOMEGALOVIRUS EN SUERO O PLASMA HUMANO PARA USO DIAGNÓSTICO IN VITRO 1. APLICACIONES CLÍNICAS El citomegalovirus (CMV) es un virus de estructura icosaédrica con un diámetro de nm, perteneciente a la familia de los Herpes virus. El virus tiene efectos citopatológicos con engrosamiento de las células huespedes con inclusiones citoplasmáticas y nucleares. El CMV está considerado como uno de los factores biológicos más importantes causantes de anomalias congénitas como consecuencia de infecciones imtrauterinas. Aproximadamente el 2% de las mujeres embarazadas contraen una infección primaria o una reinfección, mientras el 10 20% de los neonatos con infecciones congénitas causadas por CMV presentan daños significativos en el sistema nervioso central. Estas infecciones congénitas pueden ser también provocadas por una reactivación endógena del virus en la madre. Recientemente se está dando notable importancia al CMV como causa de complicaciones en el transplante de órganos, especialmente de riñón. La incidencia de infecciones por CMV tras un transplante renal de un sujeto CMV positivo a uno CMV negativo se ha estimado alrededor del %. La infección por CMV está muy difundida: anticuerpos anti-cmv se han encontrado en el 50 70% de los individuos de más de 35 años. Por otra parte el CMV ha podido aislarse en la cérvix uterina del 10% de las mujeres sanas. La infección por CMV más difundida es normalmente asintomática. Tras una infección primaria por CMV, los anticuerpos IgM, en individuos inmunocompetentes, persisten entre 2 a 9 meses. En los pacientes sometidos a transplantes o inmunodeprimidos, los anticuerpos IgM pueden persistir en el organismo durante más de 2 años. 2. PRINCIPIO DEL MÉTODO El presente kit se basa en el método inmunoenzimático (ELISA) y utiliza como marcador enzimático la peroxidasa. Durante la primera incubación los anticuerpos anti-cmv de la clase IgG eventualmente presentes en la muestra, se unen al antígeno CMV adherido a la superficie de los pocillos. Mediante un lavado se elimina aquel material que no se haya unido; en una posterior incubación se hace reaccionar un segundo anticuerpo (anti-igg humanas), conjugado con peroxidasa con el complejo ya formado entre antígenos y anticuerpos. Tras un nuevo lavado, se añade tetrametilbencidina (TMB) incolora que, al reaccionar con la peroxidasa, produce un compuesto coloreado. La reacción de desarrollo de color se para añadiendo H 2 SO 4 y la intensidad del color, medida en un espectrofotómetro a 450 nm y a 405 nm, es directamente proporcional a la concentración de los anticuerpos IgG anti-cmv presentes en los calibradores y en las muestras. 3. REACTIVOS SUMINISTRADOS CON EL KIT: PREPARACIÓN Y ESTABILIDAD Los reactivos son suficientes para 96 pocillos (REF K3CG) o para 192 pocillos (REF K3CGB). El kit debe conservarse a 2-8 C. La fecha de caducidad de cada reactivo está indicada en su etiqueta. Una vez abierto el kit es estable 2 meses a 2-8 C. M44.es Rev.13 07/2008 Pag. 3/12

4 3.1 Reactivos específicos MTP Microplaca sensibilizada: 1 o 2 microplacas de 96 pocillos/cada una divisibles individualmente, sensibilizados con CMV purificado e inactivado. Los pocillos no utilizados deben conservarse a 2-8 C en la bolsa de plástico suministrada, cerrada herméticamente. CAL Calibradores: IgG anti-cmv en matriz sérica a las siguientes concentraciones: 10, 30, 60, 120 y 240 UR/mL. Conservante: NaN 3 (<0,1%). Listo para usar y coloreados de rojo, excepto el punto 10 UR/mL coloreado de azul. Los calibradores se han tarado ante el I.S (pis) del WHO, preparación 1995 (1 UR IgG anti-cmv = UI) CONJ Conjugado Enzimático: anticuerpos monoclonales (ratón) anti-igg humanas, conjugados con peroxidasa de rábano (HRPO) en matriz sérica y estabilizantes. Conservante: Neomicina. Listo para usar y coloreado de rosa. 3.2 Reactivos Comunes para los kits de la Línea To.R.C.H. E.T.S. y Enfermedades de la infancia. WASH Solución de Lavado (concentrada): PBS-Tween 20. Conservante: Mertiolato (<0.05%). En el momento del uso diluya la cantidad necesaria 1:20 con H 2 O destilada. Si se observan cristales insolubles, resuspénderlos poniendo el vial a 37 C durante algunos minutos. Tras la dilución el tampón de lavado es estable 30 días a 2-8 C. DIL Diluyente de las Muestras (concentrado): matriz sérica y estabilizantes, coloreado de rojo. Conservante: NaN 3 (<0.1%). En el momento del uso diluya 1:20 con la solución de lavado ya diluida. Tras la dilución el diluyente es estable 30 días a 2-8 C. NEG Control Negativo: matriz sérica no reactiva a las IgG anti-cmv. Conservante: NaN 3 (<0.1%). Listo para usar y coloreado de rojo. El suero de control negativo debe utilizarse como: 1) control en el ensayo cualitativo, y 2) punto de concentración 0 UR/mL en el ensayo cuantitativo. TMB Cromógeno: Tetrametilbencidina (TMB) en tampón de citrato-fosfato, DMSO y H 2 O 2.. Listo para el uso. STOP Reactivo de Parada: H 2 SO 4 1N. Listo para usar. CPA Cubreplaca adhesivo. Bolsa de plástico con cierre. 4. MATERIAL NECESARIO NO SUMINISTRADO 4.1 Ensayo manual Micropipetas automáticas con puntas desechables de volumen variable. Incubador a 37±2 C. Cilindros graduados para la dilución de los reactivos. Bomba de aspiración o instrumento automático de lavado de microplaca. Espectrofotómetro de precisión para microplacas, capaz de medir la absorbancia en el intervalo A con una longitud de onda de 450 y 405 nm. Papel milimetrado. H 2 O destilada. 4.2 Ensayo automático El kit puede utilizarse con instrumentación automática para kits ELISA en microplaca. Se garantiza la aplicabilidad en instrumentación RADIM y/o SEAC. En el caso se utilice instrumentación automática de otros fabricantes, es responsabilidad del usuario asegurarse de que el kit haya sido oportunamente validado. M44.es Rev.13 07/2008 Pag. 4/12

5 5. ADVERTENCIAS Y PRECAUCIONES Para conseguir resultados correctos y reproducibles, deberán observarse las siguientes normas: No mezclar los reactivos específicos (vea 3.1) de lotes diferentes. Es posible utilizar reactivos comunes (vea 3.2) de lotes diferentes. No utilizar los reactivos después de la fecha de caducidad. No exponer los reactivos y las muestras al calor intenso ni a fuentes importantes de contaminación. Utilizar material de vidrio perfectamente limpio y libre de contaminación por iones metálicos o sustancias oxidantes. Utilizar agua destilada o desionizada, conservada en recipientes perfectamente limpios. Evitar cuidadosamente la contaminación entre muestras; para ello es aconsejable utilizar pipetas con puntas desechables para cada muestra y reactivo. No modificar el Procedimiento Operativo de ejecución del ensayo. Eventuales alteraciones de: secuencia y cantidades al añadir los reactivos tiempos y temperatura de incubación pueden dar lugar a resultados clínicos erróneos. Reconstituir los reactivos liofilizados según la modalidad descrita en la etiqueta; la utilización de reactivos o volúmenes no adecuados puede provocar la obtención de datos clínicos incorrectos. En el caso de procedimiento manual es importante utilizar pipetas calibradas y tener una adecuada manualidad técnica. En particular es importante la precisión en la preparación y dispensación de los reactivos. Es necesario un adecuado mantenimiento (limpieza y calibración) de tales instrumentos. Asegurarse de que la bomba de aspiración o el sistema automático para el lavado de las microplacas funcione correctamente. El lavado inadecuado de las microplacas puede causar la clasificación incorrecta de las muestras. Es necesario un mantenimiento adecuado de tales sistemas. Asegurarse de que el espectrofotómetro funcione perfectamente. El uso de un espectrofotómetro no calibrado o con filtros no limpios puede causar una lectura errónea de las muestras, con consiguiente error en su clasificación. Es necesario un adecuado mantenimiento (limpieza y calibración) de tales instrumentos. Asegurarse de que el incubador (si es necesario) funcione perfectamente. La incubación a temperaturas distintas a los 37±2º puede causar una pérdida de sensibilidad y/o desnaturación biológica de los materiales (muestras y/o reactivos). Es necesario un adecuado mantenimiento de tales instrumentos y un control periódico de la temperatura registrada. Asegurarse de que el agitador de microplacas (si es necesario) funcione perfectamente. La agitación incorrecta puede causar la clasificación errónea de las muestras. Es necesario un adecuado mantenimiento de tales instrumentos. Asegurarse de que los sistemas utilizados para la conservación de las muestras y/o el dispositivo funcione perfectamente. La conservación a temperaturas diferentes de la indicada puede causar la desnaturación biológica de los materiales (muestras y/o reactivos). Es necesario un adecuado mantenimiento de tales sistemas y un control periódico de la temperatura registrada. Utilizar un método adecuado para la correcta identificación de las muestras de los pacientes. Una identificación incorrecta puede provocar pérdida de la especificidad del sistema y resultados clínicos erróneos. M44.es Rev.13 07/2008 Pag. 5/12

6 Para evitar contaminaciones personales y ambientales, deberán observarse las siguientes normas de seguridad: Utilizar guantes desechables durante la manipulación del material potencialmente infeccioso y durante el ensayo. No pipetear los reactivos con la boca. No fumar, comer, beber o aplicar cosméticos durante la ejecución del ensayo. Las soluciones de Cromógeno y el Reactivo de Parada deben manipularse con cuidado. Evitar el contacto con la piel, los ojos y las mucosas. En caso de contaco lavar con abundante agua. Todos los materiales humanos suministrados con el kit han sido sometidos a análisis resultando negativos a la presencia de HBsAg, anti-hiv y anti-hcv. Sin embargo, los ensayos mencionados no garantizan la total ausencia de los agentes vírales responsables del síndrome de inmunodeficiencia adquirida y de la hepatitis B y C. Por eso todos los reactivos contenentes material biológico y todas las muestras deben considerarse potencialmente infecciosos. Evitar salpicaduras y formación de aerosoles; en caso de que se presenten, limpiar cuidadosamente con hipoclorito sódico a una concentración final de 3%. Todo el material utilizado para la limpieza debe tratarse como residuo potencialmente infeccioso y desecharse según las oportunas modalidades. La azida sódica, contenida como conservante en algunos reactivos, puede reaccionar con el plomo y el cobre de los desagües formando azidas metálicas altamente explosivas. Para evitar la formación y la acumulación de dichos compuestos deje correr abundantemente el agua al eliminar los reactivos. Los reactivos para los que no se suministra la ficha de seguridad no contienen sustancias químicas peligrosas o, si las contienen, están por debajo de los límites de concentración definidos en el D.Lgs.285/98 conforme a la directiva CEE 91/155. Conforme al Decreto Italiano D.L. no. 22, del y conforme a las directivas de la CEE (91/156/CEE, 91/689/CEE, 94/62/CEE), todos los desechos originados por procesos manuales y/o automáticos se clasifican como material de deshecho peligroso, código de Clasificación CER : como tales, deben eliminarse delegando su recolección y desecho a empresas especiales autorizadas para ello. 6. RECOLECCIÓN Y PREPARACIÓN DE LAS MUESTRAS El ensayo puede realizarse en muestras de suero o plasma humanos. Las muestras moderadamente lipémicas no afectan los resultados; las muestras extremadamente lipémicas o hemolizadas pueden alterar los resultados. La presencia de filamentos de fibrina podría interferir en el ensayo; asegurarse por lo tanto de que las muestras estén perfectamente limpias antes de ensayarlas. Las muestras pueden conservarse a 2-8 C durante 1 semana; para períodos más largos se recomienda conservar las muestras a -20 C. Se aconseja no congelar y descongelar repetidamente las muestras. Antes de su uso, diluir las muestras 1:300 con el diluyente de las muestras ya preparado (ejemplo: 10 µl de muestra µl de diluyente). 7. PROCEDIMIENTO OPERATIVO* Esperar que los reactivos y las muestras alcancen la temperatura ambiente. Agitar las muestras por inversión antes de utilizarlas. 7.1 Preparar los pocillos para el Blanco, el Suero de Control o Calibradores y las muestras. 7.2 Dispensar 100 µl de Suero de Control o Calibradores y muestras ya diluidas en los respectivos pocillos. Nota: el Suero de Control y los Calibradores no deben diluirse. M44.es Rev.13 07/2008 Pag. 6/12

7 7.3 Dispensar 100 µl de Diluyente de las Muestras diluido en el pocillo del blanco. 7.4 Incubar durante 60±5 minutos a 37±2 C cubriendo la microplaca con la hoja adhesiva suministrada con el kit. 7.5 Lavar los pocillos 4 veces con 350 µl (por pocillo) de solución de lavado diluida. Aspirar completamente el líquido de todos los pocillos. 7.6 Dispensar 100 µl de Conjugado Enzimático en todos los pocillos. 7.7 Incubar durante 30±2 minutos a 37±2 C cubriendo la microplaca con la hoja adhesiva suministrada con el kit. 7.8 Lavar los pocillos como en el punto Dispensar 100 µl de Cromogeno en todos los pocillos Incubar durante 10 minutos a 37±2 C o 15 minutos a temperatura ambiente (18-25 C) al resguardo de la luz Dispensar 100 µl de Reactivo de Parada en todos los pocillos Leer la densidad óptica a 450 nm, preferiblemente en un espectrofotómetro bicromático con longitud de onda de referencia de 620 nm (haciendo el cero del instrumento con el blanco). En el caso de lectura fuera del rango (overflow), leer a 405 nm. Leer en los primeros 15 minutos después de terminar el ensayo. *En caso de que se utilice en el procedimiento un sistema automático RADIM y/o SEAC para microplacas, ver el manual correspondiente. 8. ESQUEMA DEL ENSAYO: Ver pág CÁLCULO DE LOS RESULTADOS * 9.1 Ensayo cualitativo Considerar la densidad óptica de cada control negativo y calibrador Cut-off (10 UR/mL: Valor umbral). Comparando la densidad óptica de las muestras con la densidad óptica del calibrador Cut-off se determina la reactividad o no reactividad ante los anticuerpos IgG anti- CMV. Las muestras con valores de densidad óptica inferiores al valor del calibrador 10 UR/mL (calibrador Cut-off) deben considerarse no reactivas para los anticuerpos IgG anti-cmv. Las muestras con valores de densidad óptica superiores al valor del calibrador Cut-off deben considerarse reactivas para los anticuerpos IgG anti-cmv. Las muestras con valores de densidad óptica comprendidos en el intervalo de ± 10% del calibrador Cut-off, deben considerarse de interpretación dudosas y deben volverse a ensayar. 9.2 Ensayo cuantitativo El control negativo debe considerase como el primer punto de la curva de calibración con un valor de 0 UR/ml de IgG anti-cmv y por lo tanto hace parte de la misma curva. Dibuje la curva estándar en un papel milimetrado, poniendo en el eje de las abscisas las concentraciones de los calibradores y en el de las ordenadas la absorbancia obtenida para cada calibrador. Interpolando sobre la curva de calibración las absorbancias relativas a cada muestra se obtienen las correspondientes concentraciones de IgG anti-cmv en UR/mL. - Muestras con valores de IgG inferiores a 10 UR/mL deben considerarse no reactivas ante los anticuerpos IgG anti-cmv. - Muestras con valores de IgG comprendidos entre 1 UR/mL y 30 UR/ml deben considerarse débilmente reactivas. - Muestras con valores de IgG superiores a 30 UR/mL deben considerarse reactivas ante los anticuerpos IgG anti-cmv. M44.es Rev.13 07/2008 Pag. 7/12

8 * En el caso de que se utilice el sistema automático RADIM y/o SEAC para microplacas, la lectura espectrofotométrica se realiza automáticamente con 3 longitudes de onda: 450, 405 y 620 nm, permitiendo la ampliación del rango de lectura. 9.3 Ejemplo de cálculo Los valores siguientes deben considerarse únicamente como un ejemplo y no deben emplearse en lugar de los datos experimentales. Descripción Absorbancia 450 nm IgG anti-cmv Absorbancia 405 nm Calibrador 0 UR/mL Calibrador 10 UR/mL Calibrador 30 UR/mL Calibrador 60 UR/mL Calibrador 120 UR/mL Calibrador 240 UR/mL Muestra UR/mL Nota: Control Negativo = Calibrador 0 UR/mL. Interpolando sobre la curva de calibración, la muestra ensayada presenta como resultado un título de IgG anti-cmv de 80 UR/mL. 9.4 Criterios de aceptación Antes de proceder al cálculo de los resultados, verificar que las absorbancias de los controles respeten los siguientes valores: Descripción Valor esperado Control Negativo < OD Cal 240 UR/mL / OD Cal 10 UR/mL > 7.3 OD Cal 10 UR/mL / OD Cal 0 UR/mL > 3.3 Si los valores obtenidos no concuerdan con los esperados, es necesario repetir el ensayo. 9.5 Interpretación de los resultados Las muestras no reactivas deben considerarse negativas a la presencia de anticuerpos IgG anti-cmv. Las muestras reactivas y/o débilmente reactivas deben considerarse positivas a la presencia de anticuerpos IgG anti-cmv. Extracciones sucesivas de un mismo paciente pueden compararse entre ellas sólo si se procesan en el mismo ensayo; en este caso un aumento del 60% de la densidad óptica de la segunda muestra puede considerarse indicativo de una infección reciente o en curso. En tal caso se aconseja ensayar las IgM específicas. 10. CARACTERÍSTICAS METODOLÓGICAS 10.1 Especificidad diagnóstica La especificidad diagnóstica del método se ha evaluado sobre un grupo de 150 muestras no inmunes a infecciones causadas por CMV, resultando igual al 97.5% Sensibilidad diagnóstica La sensibilidad diagnóstica del método se ha evaluado sobre un grupo de 246 muestras con infección pregresa por CMV, resultando igual al 98.7%. M44.es Rev.13 07/2008 Pag. 8/12

9 10.3 Especificidad analítica La especificidad analítica se define como la capacidad del ensayo de detectar con precisión el analito en presencia de factores potencialmente interferentes en la matriz de la muestra. Estudios controlados sobre factores potencialmente interferentes han demostrado que las prestaciones del ensayo no se ven influenciadas por anticoagulantes (EDTA, citrato y heparina) Sensibilidad analítica La sensibilidad analítica puede expresarse también como el límite de detección o sea la cantidad mínima de analito detectable por el ensayo. El límite de detección es 0.07 miu/ml al 99% de confianza y se ha calculado como la concentración de analito distinguible del calibrador cero, es decir tres desviaciones estándar (SD) sobre el cero Precisión La precisión se ha evaluado en instrumentación Radim midiendo la repetitividad y la reproducibilidad (variabilidad intra-ensayo e inter-ensayo) en 3 sueros con distintas concentraciones de IgG anti-cmv. Repetitividad (intra-ensayo) Suero Media ± D.S. C.V. No. Replicados (UR/mL) % a ± b ± c 22.2 ± Reproducibilidad (inter-ensayo) Suero Media ± D.S. C.V. No. de Ensayos (UR/mL) % a ± b ± c ± LÍMITES DEL ENSAYO Debe tenerse en cuenta que, para definir el estado inmunitario de un paciente ante el CMV, la presencia de anticuerpos de clase IgG a cualquier nivel no excluye la posibilidad de una infección en curso, mientras que el ensayo de los anticuerpos específicos de tipo IgM es de importancia fundamental para el diagnóstico precoz de la infección aguda. En caso de enfermedad, una intervención rápida permite reducir considerablemente los riesgos consiguientes. Sin embargo, los resultados del ensayo deben interpretarse con cautela y convalidarse con evaluaciones clínicas y ulteriores pruebas diagnósticas. 12. LEYENDA SÍMBOLOS: Ver pág. 10 M44.es Rev.13 07/2008 Pag. 9/12

10 SÍMBOLOS EN 980 EDMA REF Código de referencia o número de pedido LOT Lote Fecha de caducidad IVD Para uso diagnóstico in vitro Marcado CE según directiva de IVD 98/79 CE Conservar a 2-8 C Producido por Riesgo biológico Consultar las instrucciones de uso Suficiente para determinaciones RDATE Fecha de referencia RCNS Reconstituir con H 2 O Agua destilada o desionizada M44.es Rev.13 07/2008 Pag. 10/12

11 BIBLIOGRAFÍA 1 - Ahlfors K. (1982). Epidemiological studies of congenital cytomegalovirus infection. Scand. J. Inf. Dis. suppl Ho M. (1977). Virus infections after trasplantation in man - A brief review. Arch. Cirol. 55, Stern H., Turker S.M. (1973). Prospective study of cytomegalovirus infection in pregnancy. Br. med. J., 2, Pass R.F., Griffith P.D., August A.M. (1983). Antibody Response to cytomegalovirus after Renal Transplanation: Comparison of Patients with Recurrent infections. J. Inf. Dis., 147, Cremer N.E., Delvin V.L., Riggs J.L., Hagens S.J. (1984). Anomalus antibody responses in viral infection; Specific stimulation or polyclonal activation. J. Clin. Microbiology, 20, M44.es Rev.13 07/2008 Pag. 11/12

12 ESQUEMA DEL ENSAYO Predilución de la muestra: 1/300 NEG CAL Pocillos Blanco NEG CAL Muestras Reactivos µl µl Muestras µl DIL 100 µl Incubar a 37±2 C, 60±5 min. Aspirar y Lavar: 4 x 350 µl. CONJ 100 µl 100 µl 100 µl 100 µl Incubar a 37±2 C, 30±2 min. Aspirar y Lavar: 4 x 350 µl. TMB 100 µl 100 µl 100 µl 100 µl Incubar a 37±2 C, 10' o T.A. 15' STOP 100 µl 100 µl 100 µl 100 µl Leer a nm. RADIM S.p.A. - Via del Mare, Pomezia (Roma) Italia Tel.: Fax: National Order Entry: Export Department: Customer Care: info@radim.com -