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- José Ángel Torres Navarrete
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1 BIO-FLASH CMV IgM tests BIO-FLASH CMV IgM es un inmunoensayo quimioluminiscente de dos pasos totalmente automatizado para la determinación cualitativa de anticuerpos IgM anti-citomegalovirus en suero o plasma humano con el instrumento BIO-FLASH. Sumario El citomegalovirus (CMV) humano pertenece al grupo de los Herpesvirus, que también incluye los Herpes virus simplex tipo 1 y 2, el virus de la Varicela Zoster y el virus Epstein-Barr. Una característica común de estos virus es que pueden causar infecciones latentes. 1 El CMV es un agente ubicuo que normalmente infecta a individuos de diversas áreas geográficas y económicas. La mayor parte de la población se ve infectada por el virus en algún momento de su vida; hasta un 81% de los individuos de Estados Unidos mayores de 35 años han estado expuestos al virus. 2 Una característica del CMV consiste en que, tras la infección primaria, el virus puede persistir en forma latente durante mucho tiempo y puede reactivarse en un momento dado. La infección, reinfección o reactivación del CMV en adultos normales y niños generalmente es leve o asintomática. Sin embargo, las infecciones en pacientes inmunodeprimidos, con cáncer o como resultado de una infección intrauterina o perinatal pueden derivar en casos clínicamente graves. 1-8 Las transfusiones de sangre y el transplante de órganos son causa importante de infección por CMV en pacientes inmunodeprimidos. 9 Se puede prevenir la transmisión del CMV a receptores de órganos mediante la selección de los donantes, que han de ser seronegativos de anticuerpos anti-cmv. La reactivación, debido a terapias inmunosupresivas, de virus latentes endógenos es otra causa importante de patología en pacientes inmunodeprimidos. 10 La detección de un aumento significativo de anticuerpos IgG específicos para CMV en sueros pareados y la detección de anticuerpos IgM específicos para CMV aportan información al diagnóstico serológico de infección por CMV. Las pruebas serológicas para la detección de anticuerpos anti-cmv son importantes en la determinación de la existencia de una infección previa, en el diagnóstico de una infección activa o reciente así como en el análisis de sangre para practicar transfusiones a recién nacidos y receptores inmunodeficientes. 11 Principio Cuando las micropartículas paramagnéticas de BIO-FLASH CMV IgM se mezclan e incuban con la muestra, si ésta presenta anticuerpos específicos anti-cmv, éstos se combinan con los antígenos de CMV que recubren las micropartículas. Después de una separación magnética y lavado para eliminar la muestra residual, se añade un trazador consistente en un anticuerpo monoclonal anti-igm humana marcado con isoluminol que se une a las IgM anti-cmv capturadas por las micropartículas. Tras una segunda incubación, separación magnética y otro lavado, se añaden los reactivos que activan la reacción quimioluminiscente. El luminómetro del BIO-FLASH mide la luz emitida en unidades relativas de luz (URL), que son directamente proporcionales a la concentración de IgM anti-cmv de la muestra. El BIO-FLASH utiliza un método de reducción de datos con ajuste a una curva logística de 4 parámetros (4PLC) para generar una Curva de Calibración Maestra (CCM). Esta curva viene predefinida, depende del lote y se almacena en el instrumento a través del código de barras del cartucho. Con la medición de los calibradores (que se suministran en un kit aparte), la CCM predefinida se transforma en una Curva de Calibración de Trabajo (CCT) nueva y específica para el instrumento. Las concentraciones de los calibradores están incluidas en los códigos de barras de los tubos de calibradores. Esquema de la reacción: LEER CAMBIOS SOMBREADOS Activadores (Triggers) URL Partícula magnética Muestra Trazador Emisión de luz
2 Componentes Cartucho de reactivos El kit BIO-FLASH CMV IgM contiene un cartucho de reactivos para 50 determinaciones (REF ). NOTA: el diseño del cartucho está protegido por patentes (US D565,741 / Diseño CE ). Composición del cartucho de reactivos: El cartucho se compone de 4 viales que contienen: A. 1 vial cilíndrico de suspensión de micropartículas recubiertas con antígeno de CMV en tampón de glicina. Contiene < 0,1% de azida sódica. B. 1 vial de tampón de ensayo. Contiene < 0,1% de azida sódica. C. 1 vial opaco de trazador que consiste en anticuerpo monoclonal murino anti-igm humana marcado con isoluminol. Contiene < 0,1% de azida sódica. D. 1 vial vacío. Preparación Véase la figura siguiente. Cartucho: las micropartículas sedimentan durante su transporte y almacenamiento, por lo que se tienen que mezclar para volverlas a resuspender. La primera vez que vaya a utilizar el cartucho, inviértalo suavemente 30 veces sin que se forme espuma (las burbujas pueden hacer que los sensores de líquido del instrumento den lecturas erróneas). Compruebe que las micropartículas se hayan resuspendido totalmente. Si no es así, siga invirtiendo el cartucho hasta que se resuspendan en su totalidad. Si las micropartículas no se resuspenden o detecta que el precinto de los reactivos está roto, NO UTILICE EL CARTUCHO. Una vez resuspendidas las micropartículas, sitúe el cartucho sobre una superficie sólida y retire con cuidado la lengüeta roja de seguridad para el transporte. Manteniendo el cartucho en la superficie sólida, apriete las dos pestañas situadas a los lados del tapón perforador (parte gris) y presione la parte superior del cartucho hasta que quede en posición de bloqueo. Una vez en posición de bloqueo, las pestañas tienen que quedar ocultas. No invierta el cartucho abierto. Deje reposar el cartucho durante 5 minutos antes de cargarlo en el instrumento. Una vez cargado el cartucho, el instrumento mezcla su contenido de forma automática a intervalos periódicos.
3 Precauciones Los reactivos BIO-FLASH son para diagnóstico IN VITRO. Uso exclusivo para profesionales. La azida sódica puede reaccionar con tuberías y desagües de plomo o cobre dando lugar a azidas metálicas altamente explosivas. Al desechar los restos de reactivos, deje correr agua abundante. ATENCIÓN: MATERIAL DE RIESGO BIOLÓGICO. Deseche todos los materiales usados en recipientes adecuados para material biocontaminante. Por favor, no reutilice ni reintroduzca reactivos en los cartuchos o viales. Clase de peligro No clasificado. Indicaciones de peligro Ninguna. Consejos de prudencia P280: Llevar guantes/prendas/gafas/máscara de protección. P : EN CASO DE CONTACTO CON LOS OJOS: Aclarar cuidadosamente con agua durante varios minutos. Quitar las lentes de contacto, si lleva y resulta fácil. Seguir aclarando. Recolección y conservación de las muestras Usar suero fresco (también se pueden utilizar tubos con gel separador de suero) o plasma (EDTA, Li-heparina, Li-heparina en tubo con gel separador, Na-heparina y Na-citrato). Otros anticoagulantes deben ser comprobados antes de utilizarse. Los anticoagulantes líquidos como el Na-citrato ejercen un efecto de dilución y pueden reducir la concentración de muestras de pacientes. Las muestras no deben ser inactivadas por calor. Las partículas en suspensión deben eliminarse por centrifugación. En las directrices CLSI H18-A3 y H21-A5 encontrará más información sobre la manipulación, el transporte, el procesamiento y la conservación de las muestras. Suero Las muestras de suero pueden ser conservadas entre 2-8 C durante 8 días. Si es por un período de tiempo más largo, deben ser congeladas a una temperatura igual o inferior a -20 C. Las muestras se pueden congelar/descongelar hasta 3 veces. Mezclar bien después de descongelarlas. Compruebe que no haya burbujas en las muestras y, en caso contrario, elimínelas en su totalidad antes del análisis. Plasma Las muestras de plasma pueden ser conservadas entre 2-8 C durante 8 días. Si es por un período de tiempo más largo, deben ser congeladas a una temperatura igual o inferior a -20 C. Descongelar el plasma a 37 C. Descongelar las muestras sólo una vez. Mezclar bien después de descongelarlas. Compruebe que no haya burbujas en las muestras y, en caso contrario, elimínelas en su totalidad antes del análisis. Volumen de muestra El volumen de muestra necesario para realizar una única prueba con el BIO-FLASH CMV IgM varía en función del tipo de recipiente que se utilice. Para una prueba se necesitan al menos 15 µl más el volumen muerto, que es de 200 µl si se utiliza la copa de muestra recomendada (REF ). Otros materiales Los siguientes materiales no se suministran con el cartucho de reactivos y deben adquirirse por separado. REF REF BIO-FLASH CMV IgM Calibrators (Calibradores) BIO-FLASH CMV IgM Controls (Controles) Lea detenidamente las instrucciones correspondientes si desea más información. No utilice otros calibradores. La información que necesita el instrumento BIO-FLASH para calibrar el ensayo BIO-FLASH CMV IgM está incluida en los códigos de barras de los viales. Utilizar controles de otros fabricantes puede dar lugar a resultados imprevistos. Asegúrese de que en el instrumento BIO-FLASH haya una cantidad suficiente de los siguientes consumibles antes de procesar muestras, calibradores o controles: REF BIO-FLASH Cuvettes (Cubetas) NOTA: el diseño de las cubetas está protegido por patentes (US D560,816 / Diseño CE ). REF BIO-FLASH Triggers (Activadores) REF REF BIO-FLASH System Rinse (Solución del sistema) BIO-FLASH Sample Diluent (Diluyente de las muestras)
4 Instrumento / realización del ensayo En el Manual del Usuario del BIO-FLASH encontrará las instrucciones completas para realizar el ensayo. Calibración El código de barras del cartucho contiene una Curva de Calibración Maestra (CCM) que es válida para el lote de reactivos. Sin embargo, para todos los reactivos se necesita una Curva de Calibración de Trabajo (CCT), que es específica para cada lote y válida hasta la fecha de caducidad de éste. Se debe obtener una nueva CCT cuando los resultados de los controles salgan fuera del rango de aceptación o cuando se hayan realizado ajustes en el instrumento. Lea detenidamente el Manual del Usuario del BIO-FLASH para configurar una CCT. Control de calidad Para realizar un programa completo de control de calidad se recomiendan dos niveles de control. Los controles BIO-FLASH CMV IgM negativo y positivo se han diseñado para dicho programa. Se recomienda que cada laboratorio establezca su propia media y desviación estándar y un programa de control de calidad para monitorizar sus resultados. Los controles se deben analizar al menos cada 24 horas por día de utilización. Si los controles están fuera de rango, puede resultar necesario recalibrar el instrumento. En el Manual del Usuario del instrumento encontrará más información. Para la identificación y resolución de situaciones anormales de control de calidad, consulte Westgard et al. 12 Conservación y estabilidad Los reactivos que no se hayan abierto se mantienen estables hasta la fecha de caducidad indicada en la etiqueta del cartucho si se conservan entre 2-8 C en posición vertical. Una vez abierto, la estabilidad del cartucho cargado en el instrumento BIO-FLASH o guardado a 2-8 C es de 14 semanas. Interpretación de resultados La cantidad de analito en cada muestra se determina a partir de la luz emitida (URL), mediante interpolación en la Curva de Calibración de Trabajo almacenada. Los resultados del BIO-FLASH CMV IgM se expresan como S/CO (Señal de la muestra/valor de corte). Como el ensayo es cualitativo, el valor numérico del resultado sólo es indicativo de la cantidad de anticuerpo presente. La determinación de las IgM anti-cmv con el ensayo BIO-FLASH CMV IgM ayuda en el diagnóstico de una infección reciente. Las muestras con un resultado < 0,90 S/CO se consideran no reactivas (negativas). Las muestras con un resultado 0,90 y < 1,10 S/CO se consideran indeterminadas (zona gris). Las muestras que se interpreten como indeterminadas deben reanalizarse. Si al reanalizarse se obtiene un resultado indeterminado, se debe reportar como tal y debe realizarse otro ensayo con un método alternativo o debe obtenerse y analizarse una segunda muestra. Las muestras con un resultado 1,10 S/CO se consideran reactivas (positivas). Como en todos los inmunoensayos sensibles, existe la posibilidad de obtener resultados positivos que no se repitan. Un resultado negativo no excluye la posibilidad de infección por CMV. Una posible seroconversión debe confirmarse mediante determinación cuantitativa de las IgG específicas con, por ejemplo, el BIO-FLASH CMV IgG REF , analizando muestras pareadas tomadas con un intervalo de 2-4 semanas. Limitaciones El resultado de una única muestra no es suficiente para diagnosticar una infección primaria por CMV. Por tanto, además de los resultados de BIO-FLASH CMV IgM deben tenerse en cuenta otros datos como, por ejemplo, la sintomatología, la historia clínica, los resultados de otras pruebas y demás información relevante. Los anticuerpos heterófilos del suero humano pueden reaccionar con las inmunoglobulinas de los reactivos y causar interferencias en los inmunoensayos in vitro. 13 Los datos obtenidos pueden indicar que la presencia de anticuerpos heterófilos en la muestra puede dar lugar a falsos positivos. Resultados esperados La infección por CMV puede ocurrir a cualquier edad, incluso en la etapa fetal. Alrededor del 50% de los adultos jóvenes de Europa Central están infectados por CMV. Alrededor del 70%-80% de la población de mayor edad son seropositivos. Tras el nacimiento, el índice de manifestación de la infección por CMV es inferior al 1% en personas inmunocompetentes. 14 En un estudio realizado en Estados Unidos, la prevalencia de la infección por CMV fue del 58,9% en personas 6 años de edad. La seroprevalencia del CMV aumentó gradualmente con la edad, del 36,3% en niños de 6-11 años al 90,8% en personas de edad 80 años. 15
5 Características funcionales NOTA: los datos siguientes son representativos; los resultados en experimentos aislados pueden variar respecto a estos datos. Comparación de métodos BIO-FLASH CMV IgM se evaluó en estudios comparativos con otros ensayos comerciales. Evaluaciones Se realizó una evaluación interna y otra externa en el Servei de Microbiologia del Hospital de la Santa Creu i Sant Pau de Barcelona (España). En la evaluación interna se analizaron con BIO-FLASH CMV IgM 154 muestras de distinta procedencia que incluían sueros positivos y negativos de anticuerpos IgM anti-cmv y los resultados se compararon con los obtenidos con un método de EIA CMV IgM comercial. En la evaluación externa se analizaron con BIO-FLASH CMV IgM 311 muestras de distinta procedencia que incluían sueros positivos y negativos de anticuerpos IgM anti-cmv y los resultados se compararon con los obtenidos con un método comercial, ELFA CMV IgM. Se adjuntan los resultados globales. En los cálculos no se tuvieron en cuenta los resultados indeterminados. Método de referencia BIO-FLASH CMV IgM IND NEG POS Total IND NEG POS Total Se obtuvieron los siguientes resultados iniciales de sensibilidad y especificidad relativas y concordancia global: Sensibilidad relativa Especificidad relativa Concordancia global N Valor IC del 95% Valor IC del 95% Valor IC del 95% ,2% 85,3% a 96,6% 95,5% 92,8% a 97,4% 94,7% 92,3% a 96,6% Las muestras discrepantes se analizaron con métodos de ELFA CMV IgM y EIA CMV IgM comerciales. Cuatro de las muestras se resolvieron a favor de BIO-FLASH CMV IgM. Tras el ensayo adicional se obtuvieron los siguientes resultados finales de sensibilidad y especificidad y concordancia global: Sensibilidad final Especificidad final Concordancia global final N Valor IC del 95% Valor IC del 95% Valor IC del 95% ,2% 87,9% a 97,9% 96,9% 94,5% a 98,4% 96,3% 94,1% a 97,8% Precisión Se evaluó, conforme a las directrices CLSI EP05-A, la precisión intra-ensayo y total (ensayo a ensayo y día a día) en múltiples ensayos. Los resultados se resumen en la tabla siguiente: Media (S/CO) Intra-ensayo Total Control negativo 0,25 0,016 SD 0,023 SD Control positivo 2,65 4,4% CV 4,9% CV Alrededor del valor de corte 0,77 6,5% CV 10,2% CV Interferencias Estudios conforme a las directrices CLSI EP7-A han demostrado que las siguientes sustancias potencialmente interferentes no alteran los resultados de BIO-FLASH CMV IgM: Sustancia potencialmente interferente Concentración % Interferencia Hemoglobina 500 mg/dl 10 Bilirrubina indirecta 18 mg/dl 10 Bilirrubina directa 18 mg/dl 10 Triglicéridos 1300 mg/dl 10 Factor reumatoide 543 UI/mL 10
6 Reactividad cruzada Cuando se analizaron 109 muestras con potencial de producir reacción cruzada con BIO-FLASH CMV IgM y se compararon los resultados con ensayos CMV IgM comerciales se evidenció la siguiente concordancia: Posible reacción cruzada Concordancia Anti-HIV (anticuerpos frente al virus de la inmunodeficiencia humana) 5/5 HAMA (anticuerpo humano antimurino) 5/5 SLE (lupus eritematoso sistémico) 8/10 ANA (anticuerpos antinucleares) 5/5 Anti-EBV (anticuerpos frente al virus Epstein-Barr) 4/5 Anti-PV B19 (anticuerpos frente a Parvovirus B19) 7/7 Anti-HSV 1 (anticuerpos frente a Herpes simplex virus tipo 1) 5/5 Anti-VZV (anticuerpos frente al virus de la Varicela Zoster) 5/5 Paraproteínas IgG e IgM 5/6 IgG e IgM elevadas 8/10 Anticuerpos heterófilos 9/13 RF (Factor reumatoide) 9/10 Mujeres embarazadas (multíparas incluidas) 22/23
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