TP Nro 6 Validación de Métodos Analíticos

Transcripción

1 TP Nro 6 Validación de Métodos Analíticos 1. Introducción: La validación de un método es el procedimiento por medio del cual se definen los requerimientos analíticos y se confirma que el método en consideración cumple las condiciones de necesarias. Esto implica que es necesario evaluar esas características de performance de los métodos utilizados. Queda sobreentendido que el equipamiento utilizado en la validación se encuentra adecuadamente calibrado y funcionando correctamente dentro de las especificaciones. Además, el personal que lleva a cabo estos estudios debe ser experimentado y competente, tener suficiente conocimiento sobre la técnica en cuestión para poder tomar decisiones acertadas a medida que avanza el estudio. Los parámetros más importantes que se evalúan durante el proceso de validación son: Selectividad Linealidad Sensibilidad: límite de detección, límite de cuantificación Exactitud Precisión: repetibilidad, precisión intermedia, reproducibilidad Incertidumbre Robustez La definición de cada uno de estos parámetros se encuentra en el anexo I de esta guía. Una vez que se está trabajando con un método validado es necesario demostrar que en todo momento el mismo cumple con los criterios de aceptación previamente definidos. Para ello deben utilizarse muestras cuyos resultados sean conocidos y efectuar controles de calidad programados. 2. Objetivo: El objetivo del presente trabajo es definir rango lineal, límite de cuantificación, límite de detección, exactitud, repetibilidad y precisión intermedia a partir de datos obtenidos en el laboratorio en el desarrollo de una metodología analítica para detección del antibiótico cefquinome en carne de cerdo.

2 3. Datos Los datos necesarios para calcular cada uno de los parámetros se encuentran en el anexo II de esta guía. Para los cálculos se utilizará el programa Excel.

3 4. Resultados A partir de los resultados presentados en el punto 3. defina los siguientes parámetros del método 4.1. Linealidad y rango lineal 4.2 Límite de cuantificación 4.3 Exactitud 4.5 Repetibilidad 4.6 Explique de qué manera se preparan las muestras que se utilizarán para el desarrollo de la validación 4.7 Explique qué ensayo debería realizar para conocer la reproducibilidad del método. En qué momento de la validación considera que debe realizarse este paso? 4.8 Además de los parámetros de validación del método, qué debe definirse para determinar si el mismo podrá cumplir con el propósito para el cual fue desarrollado?

4 ANEXO I DEFINICIONES Validación de métodos analíticos Son innumerables las razones para realizar mediciones analíticas, por ejemplo evaluar la calidad de agua para consumo, realizar con éxito estudios farmacológicos, apoyar al cuidado de la salud, determinar la presencia de residuos de metales pesados. Cada aspecto de la sociedad es mantenido de alguna manera por mediciones analíticas. Es importante determinar el resultado correcto y poder determinar que es correcto ya que el resultado que emita el laboratorio permitirá tomar decisiones que condicionará el destino del producto en cuestión. Para que un resultado analítico sea específico para tal propósito debe ser suficientemente confiable para que cada decisión basada en él pueda ser tomada con confianza. La validación bioanalítica de un método incluye todos los procedimientos que demuestran que un método particular usado para medir cuantitativamente analitos en una determinada matriz biológica, tales como sangre, plasma, suero, u orina es confiable y reproducible para el propósito previsto. Generalmente el laboratorio que desarrolla y valida un método se basa en una guía que proporciona recomendaciones, aunque estas recomendaciones pueden ajustarse o modificarse dependiendo del método específico usado. El laboratorio también debe decidir que parámetros se deben caracterizar para validar el método y confirmar mediante la provisión de evidencia objetiva que los requerimientos particulares para tal propósito específico fueron realizados. Decidiendo el nivel de validación requerido Los métodos analíticos publicados a menudo se modifican para satisfacer los requisitos del laboratorio que realiza el análisis. Estas modificaciones se deben validar para asegurar el funcionamiento conveniente del método analítico. Los diferentes tipos y niveles de la validación se definen: Validación completa: La validación completa es importante al desarrollar e implementar un método analítico por primera vez, o para determinar una droga nueva o si se determinan metabolitos en la cuantificación de una droga en un análisis existente Validación parcial: Las validaciones parciales son modificaciones de métodos analíticos ya validados. La validación parcial puede extenderse de tan poco como una determinación de la exactitud y de la precisión intra-laboratorio a una validación casi completa. Los cambios analíticos típicos del método que caen en esta categoría incluyen por ejemplo: transferencias del método analítico entre laboratorios o analistas; cambios en la metodología analítica (por ej., cambio en el sistema de detección); cambios en el anticoagulante usado en la recolección del fluido biológico; cambios en la matriz dentro de la especie (ej., plasma humano y orina humana) o cambios de la especie dentro de la misma matriz (ej., plasma de rata y plasma humano). También si se realizan cambios en el procesamiento de la muestra o se debe demostrar la selectividad de un analito en presencia de metabolitos específicos, entre otros. La fase del desarrollo del método define el análisis químico. La guía internacional Bioanalytical Method Validation, Guidance for Industry, 2001, define los parámetros a determinar para realizar la

5 validación de un método bioanalítico: linealidad, selectividad, exactitud, precisión, recuperación, límite de cuantificación y estabilidad. Linealidad es la capacidad de una metodología analítica para obtener resultados directamente proporcionales a la concentración o cantidad del analito en un rango definido. Se determina mediante la elaboración de una curva de calibración, la cual relaciona la respuesta del instrumento y concentraciones conocidas del analito. La curva se debe preparar en la misma matriz biológica de las muestras, fortificando la matriz con concentraciones conocidas del analito. De esta manera se define rango lineal: es el intervalo entre la concentración superior e inferior de analito para el cual se ha demostrado la correcta precisión, exactitud y linealidad del método descrito. Selectividad es la capacidad de un método analítico de distinguir y de cuantificar el analito en presencia de otros componentes presentes en la muestra, como ser, componentes endógenos de la matriz, metabolitos, productos de la descomposición, impurezas. La exactitud describe la proximidad entre el resultado obtenido y el valor considerado como verdadero (concentración nominal) del analito. Se expresa como el error relativo (ER). Este parámetro puede ser referido como recuperación. La recuperación describe la eficacia de la extracción de un proceso analítico. El recupero de un analito se obtiene comparando la respuesta del detector obtenida de una muestra fortificada con una cantidad conocida del analito extraída desde la matriz biológica con la respuesta obtenida del detector para la misma concentración de estándar analítico, el cual representa el 100% de recupero. La recuperación se debe demostrar para 3 concentraciones (baja, media y alta) del rango lineal. La precisión describe la proximidad de los valores de una serie repetida de ensayos analíticos que se realizan sobre una muestra homogénea. Se expresa como coeficiente de variación (CV). Precisión y exactitud deben determinarse para al menos 3 concentraciones en el rango lineal. límite de cuantificación (LDC): Se define como la cantidad mínima de un analito en una muestra que se puede determinar cuantitativamente con la precisión y la exactitud convenientes. El punto mas bajo de la curva de calibración se debe aceptar como el límite de la cuantificación si se cumplen las siguientes condiciones: - La respuesta del analito en el LDC debe ser por lo menos 5 veces la respuesta comparada a la respuesta de un blanco. - El pico del analito debe ser identificable, discreto, con una precisión inferior a 20% y exactitud de ± 20%. Estabilidad: La estabilidad de la droga en la matriz biológica es una función de las condiciones de almacenaje, de las características químicas de la droga, de la matriz, y del tipo de envase. Los procedimientos de la estabilidad deben evaluar la estabilidad de los analitos durante la recolección y manipulación de la muestra, almacenaje a largo plazo (congelado en la temperatura prevista del almacenaje) y a corto plazo (en la mesada de trabajo a temperatura ambiente), y después de pasar ciclos de congelado y descongelado. Las condiciones usadas en experimentos de la estabilidad deben

6 reflejar las situaciones probablemente que se encontrarán durante la manipulación y el análisis real de la muestra.