BIOANÁLISIS DE PROTEÍNAS TERAPÉUTICAS

Transcripción

1 BIOANÁLISIS DE PROTEÍNAS Introducción TERAPÉUTICAS Caracterización farmacocinética: Determinación de niveles de proteínas en fluidos biológicos Estudios de inmunogenicidad: Determinación y caracterización de anticuerpos anti-proteína Carles Celma Director del Área de Fármacos Biológicos Kymos Pharma Services S.L. Parc Tecnològic del Valles II Jornada sobre los Ensayos Clínicos Fase I en España, 14 junio 2017, Barcelona

2 Introducción Fármacos biológicos 2

3 Fármaco biológico Molécula compleja Difícil de analizar Obtenida de células vivas (EMA) Productos derivados de la sangre y el plasma Vacunas Alérgenos Proteínas humanas / Anticuerpos monoclonales recombinantes Productos relacionados con terapias celulares y génicas 3

4 Proteína recombinante terapéutica Se obtiene a partir de la introducción de la secuencia de DNA en un cultivo de células huésped, diferente de la que la produce habitualmente (humana) y se somete a un proceso de extracción y purificación. Existe una gran interrelación entre el proceso productivo y el producto: Los cambios en los procesos productivos/formulación deben justificarse con estudios complejos (hasta estudios clínicos fase III). Innovadores: Cambios en instalaciones, modificaciones de proceso, formulaciones Biosimilares: Mucha mayor complejidad que en el caso de los genéricos

5 Estudios farmacocinéticos Bioanálisis de proteínas 5

6 Métodos Bioanalíticos Gold Standard: Métodos inmunológicos ELISA: Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay ECLA: Electro Chemi Luminiscence Assay RIA: Radio Immuno Assay Métodos innovadores LC-MS/MS: Digestión tríptica de la proteína + cuantificación de péptidos diagnostico Validación: Guidelines EMA y FDA Guideline on bioanalytical methods validation, EMEA/CHMP/EWP/192217/2009 Guidance for the Industry: Bioanalytical method validation FDA/CDER/CVM, May

7 ELISA: Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay

8 ECLA: Electro Chemi Luminiscence Assay

9 RIA: Radio Immuno Assay RIPA: Radio Immuno Precipitation Assay Proteína A Analito Analito 125 I Inmunocomplejo

10 LC-MS/MS Mid size protein (23 KD) in rat plasma LC-MS/MS vs ELISA

11 El método inmunológico: Validación Curva concentración-respuesta sigmoidea Características de ensayo Curva de calibración en matriz / buffer Evaluación de la dilución máxima (compromiso sensibilidad / efecto matriz) Regresión logística de 4 o 5 parámetros: PL4 / PL5 No se dispone de IS: Muestras duplicadas cumpliendo un criterio de aceptación (< 20% entre replicados) Rango de trabajo de la curva limitado: Múltiples diluciones Elevada sensibilidad (low pg/ml) Análisis de muestras Interpolación de la respuesta en la curva de calibrado Introducción de controles de calidad: Regla 4/6/20 Incurred samples (30% respecto a la media para el 67% de muestras) Parámetros de Validación Especificidad (Cross-reactividad substancias relacionadas) Selectividad (Efecto matriz). Curva de calibración (exactitud y precisión de los valores recalculados) Criterio de aceptación: mínimo 6 estándares 20% excepto en el LLOQ que es 25% Exactitud y precisión intra e inter ensayo (6 experimentos, 5 concentraciones mínimo incluyendo LLOQ y ULOQ ) Criterio de aceptación 20% excepto en el LLOQ que es 25% Efecto de la dilución. Criterio de aceptación 20% respecto al valor nominal no diluido y 20% en la precisión de los replicados (en ocasiones se incluye como un QC más en el estudio de exactitud y precisión) Paralelismo Estabilidad: Soluciones stock y de trabajo, durante el procesado, congelación y descongelación, almacenamiento a largo plazo Criterio de aceptación: 20% respecto al valor nominal y 20% en la precisión de los replicados 12

12 Determinación de anticuerpos anti-proteína 13

13 La inmunogenicidad es el aspecto clave desde el punto de vista de seguridad en el desarrollo de las proteínas Las proteínas recombinantes pueden generar una respuesta inmune en un paciente (ADA- anti drug antibodies) dependiendo de varios factores Factores relacionados con el paciente Predisposición genéticas, edad, presencia de infecciones, fallos de órganos, uso de inmunosupresores, tratamientos previos con proteínas similares, etc. Factores relacionados con el fármaco Estructura de la proteína, formulación, via y régimen de administración, agregación, impurezas (HCP), glicosilación, puentes disulfuro erróneos Efectos: Alteración del perfil farmacocinético Disminución de la eficacia Neutralización de proteínas endógenas Fases del desarrollo en que puede ser necesario detectar ADA s Preclinica: Toxicología y desarrollo de formulaciones de liberación sostenida. Los estudios con animales no tienen carácter predictivo Fases I -III Post marketing

14 Estrategia del ensayo y validación: Guidelines EMA y FDA sobre la inmunogenicidad Guideline on immunogenicity testing assessment of biotechnology derived therapeutic proteins, EMEA/CHMP/BMWP/14327/2006 Guidance for the Industry: Assay development for immunogenicity testing of therapeutic proteins (Draft) FDA/CDER/CBER, December 2009 Positivo Ensayo Confirmatorio (2) Competencia con el producto en el ensayo de Screening Positivo Ensayo Neutralizante (3) Inhibición de la actividad biológica Positivo Estrategia del Ensayo Ensayo de Screening (1) Definición de un cut-point Titulación Isotipado Correlación con las observaciones clínicas? Negativo Negativo Negativo RESULTADO Estrategia de la validación (ensayos 1 y 2) Es semicuantitativo / quasicuantitativo Cut-point para los ensayos de screening y confirmatorio (50 pacientes no tratados, dos ensayos) Sensibilidad Precisión intra e inter ensayo (sreening y confirmatorio) en 6 ensayos Muestra negativa, positiva baja, positiva intermedia y positiva alta Criterio de aceptación: 30% negativa, 20% positivas Efecto matriz Titulación Tolerancia a la presencia del fármaco / disociación Estabilidad. Soluciones stock y de trabajo, durante el procesado, congelación y descongelación, almacenamiento a largo plazo. Criterio de aceptación: 20% respecto al valor nominal y 20% en la precisión de los replicados 15

15 ADA Neutralizantes Efecto Ensayo Celular / Actividad biológica Efecto Anticuerpo No neutralizante Efecto Estrategia de la validación Especificidad Sensibilidad Precisión Anticuerpo Neutralizante

16 SEC- HPLC ELISA Muchas gracias por su atención ECLA 18