Detección de alérgenos de soja y huevo en productos cárnicos y en pastas

Transcripción

1 Detección de alérgenos de soja y huevo en productos cárnicos y en pastas Dra. Karina Cellerino UNIVERSIDAD DE BUENOS AIRES. Facultad de Farmacia y Bioquímica. Cátedra de Bromatología. 72º Congreso Argentino de Bioquímica 22 al 25 de agosto de 2017 Hotel Panamericano, Ciudad Autónoma de Buenos Aires Afrontando el Constante Desafío de la Bioquímica 1

2 Métodos analíticos para la detección de alérgenos en alimentos Electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato de sodio (SDS-PAGE) Inmunoblotting ELISA (Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay) Inmunocromatografía Biosensores Reacción en cadena de la polimerasa (PCR) Espectrometría de masa 2

3 Objetivo Desarrollo de enzimoinmunoensayos competitivos para la detección de la presencia de trazas de soja en productos cárnicos y de huevo y de soja en productos farináceos (pastas secas). 3

4 En la elaboración de los productos cárnicos es frecuente el agregado de proteínas extrínsecas (soja), debido a que sus propiedades funcionales mejoran las características organolépticas y el rendimiento de este tipo de productos. Estas materias primas proteicas actúan como agentes de retención de agua y emulsionantes de grasa, mejoran la liga durante el masajeo, permiten obtener muy buena coagulación durante la cocción y confieren brillo y humectación al producto terminado. En la elaboración de productos farináceos es posible encontrar presencia de huevo y/o de soja aún cuando dichas materias primas no son declaradas en los respectivos rótulos. 4

5 Métodos Desarrollo de los Enzimoinmunoensayos Competitivos Puesta a punto: Se determinó la concentración óptima de antígeno (extracto de soja o huevo*) a inmovilizar en la placa y la dilución óptima de anticuerpo primario (antisuero policlonal de conejo específico de proteínas de soja o huevo) a utilizar en la competencia. Validación: Linealidad Límite de detección y cuantificación Precisión Recuperación * Buffer Tris-ClH 0,0625 M, ph: 6,8 (3 % de SDS y 2 % de 2-mercaptoetanol) 5

6 Enzimoinmunoensayo competitivo desarrollado para la detección de proteínas de soja en productos cárnicos 6

7 Puesta a punto Curvas obtenidas para la determinación de la concentración óptima de antígeno soja y la dilución de anticuerpo primario a utilizar en el enzimoinmunoensayo competitivo final. La concentración de antígeno seleccionada fue 1 g de proteína de soja /100 L de buffer Carbonato/ Bicarbonato, ph: 9,6. La dilución de anticuerpo primario seleccionada para utilizar en la competencia fue de 1/1250 (ln 1/dilución Anticuerpo Primario: 7,13). 7

8 Linealidad Curva de calibración: Absorbancia corregida en función del ln de la concentración de soja ( g proteína de soja/ml). El rango de trabajo 0,01; 0,03; 0,1 y 0,3 g proteína de soja/ml se comportó en forma lineal. Se calculó el rango de trabajo correspondiente a proteína de soja en producto cárnico: 9 ppm-280 ppm. 8

9 Límite de detección y Límite de cuantificación: Límite de detección: 9,0 ppm de proteína de soja. Límite de cuantificación: 18,0 ppm de proteína de soja. Precisión Intradía e Interdías: Precisión del método en el día CV: 7,8 (n=3) Precisión del método entre días CV: 12,7 (n=9). Recuperación: Se analizaron sistemas modelo de carne vacuna con 75 y 20 ppm de proteína de soja. Se obtuvieron resultados inferiores a los esperados (23 y 17 ppm, respectivamente). Esto indica que la recuperación de este ensayo no es adecuada posiblemente por interferencia de la matriz cárnica ya sea en la extracción de las proteínas de soja y/o en la detección de dichas proteínas. De acuerdo con estudios previos, algunos ELISA comerciales también presentan valores muy inferiores a los esperados en sistemas modelo cárnicos analizados. 9

10 Resultados obtenidos en la determinación de proteínas de soja en productos cárnicos Muestras Ingredientes ELISA R-Biopharm ppm proteína de soja Enzimoinmunoensayo desarrollado ppm proteína de soja CH1 Carne vacuna >20,0 39,1+3,1 CH2 Carne vacuna 5,2+1,6 29,0+3,5 CH3 Carne vacuna <2,5 <18,0 CE6 CS1 No se conoce la composición de esta muestra No se conoce la composición de esta muestra >20,0 >280,0 >20,0 >280,0 10

11 Enzimoinmunoensayo competitivo desarrollado para la detección de proteínas de huevo en productos farináceos (pastas secas) 11

12 Puesta a punto Curvas obtenidas para la determinación de la concentración óptima de antígeno huevo y la dilución de anticuerpo primario a utilizar en el enzimoinmunoensayo competitivo final. La concentración de antígeno seleccionada fue 1 g de proteína de huevo /100 L de buffer Carbonato/ Bicarbonato, ph: 9,6. La dilución de anticuerpo primario seleccionado para utilizar en la competencia fue de 1/

13 Linealidad Curva de calibración: Absorbancia corregida en función del ln de la concentración de huevo ( g proteína de huevo/ml). El rango de trabajo 0,01; 0,03; 0,1 y 0,3 g proteína de huevo/ml se comportó en forma lineal. Se calculó el rango de trabajo correspondiente a proteína de huevo en pastas secas: ppm. 13

14 Límite de detección y Límite de cuantificación: Límite de detección: 23,0 ppm de proteína de huevo. Límite de cuantificación: 45,0 ppm de proteína de huevo. Precisión Intradía e Interdías: Precisión del método en el día CV: 2,7 (n=3). Precisión del método entre días CV: 6,8 (n=9). Recuperación: Se analizaron sistemas modelo de pastas secas con 150 y 300 ppm de proteína de huevo. Recuperación: 104,7 %. 14

15 Resultados obtenidos en la determinación de proteínas de huevo en pastas secas comerciales Muestras ELISA R-Biopharm ppm huevo entero en polvo Enzimoinmunoensayo desarrollado ppm proteína de huevo F10 <0,5 <45,0 F11 >13,5 98,0+9,6 F12 >13,5 <45,0 F13 >13,5 <45,0 F14 >13,5 281,0+14,0 F15 >13,5 178,0+ 13,0 F16 >13,5 <45,0 15

16 Enzimoinmunoensayo competitivo desarrollado para la detección de proteínas de soja en productos farináceos (pastas secas) 16

17 Linealidad El rango de trabajo 0,01; 0,03; 0,1 y 0,3 g proteína de soja/ml se comportó en forma lineal. Se calculó el rango de trabajo correspondiente a proteína de soja en pastas secas: 15 ppm-420 ppm. Límite de detección y Límite de cuantificación: Límite de detección: 47,0 ppm de proteína de soja Límite de cuantificación: 76,0 ppm de proteína de soja. Precisión Intradía e Interdías: La precisión del método en el día CV: 12,7 (n=3) La precisión del método entre días CV: 15,0 (n=9). Recuperación: Se analizaron sistemas modelo de pastas secas con 150 y 300 ppm de proteína de soja. Recuperación: 106,3 %. 17

18 Resultados obtenidos en la determinación de proteínas de soja en pastas secas Muestras ELISA R-Biopharm ppm proteína de soja Enzimoinmunoensayo desarrollado ppm proteína de soja F17 >20,0 <76 F18 >20,0 >420 F19 >20, F20 >20,0 >420 F21 14,3+1,1 <76 F22 9,7+1,4 <76 F23 <2,5 <76 F24 <2,5 <76 18

19 Conclusiones 19

20 Los parámetros de validación determinados para el enzimoinmunoensayo competitivo desarrollado para la detección de soja en productos cárnicos, resultaron adecuados, excepto la recuperación, posiblemente por interferencia de la matriz cárnica ya sea en la extracción de las proteínas de soja y/o en la detección de dichas proteínas. Los parámetros de validación determinados para el enzimoinmunoensayo competitivo desarrollado para la detección de soja o de huevo en pastas secas, resultaron adecuados. Para la detección de muy bajas concentraciones de soja, en productos cárnicos y de huevo o de soja en pastas secas se podría utilizar el enzimoinmunoensayo competitivo desarrollado como método de screening. Si con los enzimoinmunoensayos competitivos desarrollados los resultados son positivos se puede confirmar la presencia de proteínas de soja o de huevo. En cambio si los resultados son negativos, estos se deben confirmar con un kit comercial de ELISA de adecuada sensibilidad. En la actualidad se continúa trabajando en el mejoramiento de la sensibilidad de los enzimoinmunoensayos desarrollados. 20

21 El método a utilizar para la detección de los diferentes alérgenos en los alimentos, depende del alérgeno que se quiere detectar y/o cuantificar, de la matriz del alimento que contiene al alérgeno y del tratamiento que haya sufrido el alimento. Por lo tanto para cada alérgeno y para cada matriz en particular resulta necesario realizar un estudio de las diferentes metodologías disponibles para establecer los alcances de cada una de ellas y determinar cuáles son las que resultan más adecuadas en cada caso en particular. 21

22 Muchas Gracias! 72º Congreso Argentino de Bioquímica 22 al 25 de agosto de 2017 Hotel Panamericano, Ciudad Autónoma de Buenos Aires Afrontando el Constante Desafío de la Bioquímica 22