UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO FACULTAD DE MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA

Transcripción

1 UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO FACULTAD DE MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA. Estudio comparativo del diagnóstico del virus del PRRS por RT-PCR, PCR anidada y RT-PCR en tiempo real. Zoalli Angélica Uribe Villanueva Amanda Gayosso Vázquez Rogelio A. Alonso Morales Julio 2015

2 Introducción Síndrome Respiratorio Reproductivo Porcino (PRRS) 1987 (Mengeling et. al., 2003; Holkamp et. al. 2013; Herrera, 2012)

3 Organización del genoma Orden Familia Género Nidovirales Arteriviridae Arterivirus ORF 1a y b ORF 2, 3 y 4 ORF 5: Envoltura ORF 6: Membrana ORF 7: Nucleocápside (Dea et al., 2000, Macías, et. al. 2006, Witte et. al 2000)

4 Clínico Serológico Dx. Virológico Molecular

5 RT (Transcripción reversa) PCR- anidada PCR (Reacción en Cadena de la Polimerasa)

6 RT-PCR-TR o qrt-pcr Técnica que permite simultáneamente amplificar y cuantificar de forma absoluta el producto de la amplificación de ADN en cada ciclo de la PCR.

7 Fluorescencia qrt-pcr Detecta los niveles de fluorescencia en cada ciclo de amplificación ADN C+ Línea base: son los ciclos de la PCR en los que la señal fluorescente se acumula pero está por debajo de los límites de detección (Ct3 -> Ct15) Línea base Ct > ADN Muestra <ADN Ct: número del ciclo de la PCR en donde la amplificación es detectada y comienza a ser exponencial. Se correlaciona con el número de moléculas de ADN iniciales. Ciclos

8 JUSTIFICACIÓN Debido a la alta prevalencia, propagación y pérdidas económicas que genera el virus de PRRS, se requiere un sistema de diagnóstico oportuno, así como la identificación de las variantes virales que circulan en dentro de las granjas. Existen kits moleculares comerciales que emplean RT- PCR-TR, sin embargo estos son importados, costosos y con tiempo de entrega porlongado. Es importante desarrollar y evaluar métodos alternativos de diagnóstico basado en PCR de TR como una solución más económica y con disponibilidad inmediata.

9 OBJETIVO Evaluar las técnicas de RT-PCR, PCR anidada y RT- PCR-TR para el diagnóstico molecular del virus de PRRS, comparando los niveles de sensibilidad, el tiempo de desarrollo de las pruebas y sus costos.

10 MATERIAL RT-PCR ORF 5: 793 pb ORF 7: 557 pb PCR anidada ORF 5: 740 pb ORF7: 370 pb O R F 5 O R F 7

11 MATERIAL RT-PCR ORF 5: 793 pb ORF 7: 557 pb RT-PCR-TR PCR anidada UTR3 : 114 pb ORF 5: 740 pb ORF7: 370 pb O R F 5 O R F 7

12 MATERIAL Virus RT-PCR-TR Región Tamaño del amplicón PRRS IA Estándar de cuantificación : ppz6; ARN PRRS Control interno (descartar falsos negativos) Color UTR3 114pb Amarillo Proteína M 101pb Verde ppz6 ARN PRRS Prot. M PRRS IA

13 Construcción y estandarización de un control positivo y estándar de cuantificación viral para la qrt-pcr Extracción de ARN vacunal Clonación del amplicón UTR3 al vector ptz57r/t Cuantificación del control positivo ppz6 Concentración: 107ng/µl Estandarización del control positivo ppz6 No. de moléculas 3.04x10 8 moléculas/ng

14 Ct Evaluación de los niveles de sensibilidad y repetibilidad de los ensayos empleando el control positivo ppz6 8 diluciones del ADN ppz6 de 1ng (3.04x10 8 moleculas) a 1x10-8 ng (3.04x10 1 moleculas) 35 Curva de cuantificación ppz E E E E E+09 No. de moléculas Ensayo 1 con 8 puntos Ensayo 2 con 8 puntos Ensayo 3 con 7 puntos Ensayo 4 con 7 puntos Ensayo 5 con 7 puntos Ensayo 6 con 7 puntos Ensayo 7 con 7 puntos Ensayo 8 con 7 puntos

15 Ct % Evaluación de los niveles de sensibilidad y repetibilidad de los ensayos empleando el control positivo ppz Promedio de los ensayos con desviación Coeficiente de estándar variación de cada dilución de la curva de cuantificación ppz6 DE 0 DE DE 0.58 DE E+07 DE 0.91 DE E % 4.67% 3.71% 4.13% DE % 3.13% 1.91% 0% 2.75% DE E+05 DE E E E E E E+09 No. de moléculas Color Dilución No. de moléculas 3.16E+08 1x10-1 ng1x10-2 ng1x10-3 ng1x10-4 ng1x10-5 ng1x10-6 ng1x E+03 ng1x10-8 ng C- Diluciones 6.30E E E+02 El rango dinámico de cuantificación del ensayo va de 3.16x10 8 a 1.91x10 3 moléculas. Para un ensayo qrt-pcr se requieren 6 diluciones decuples seriadas del plásmido ppz6 partiendo de 1ng. Promedio Ct DE Ct CV% Ct x x x x x x x x x x x x x x x x10 1 C x10 2 No. de moléculas calculadas

16 Pruebas de sensibilidad de la RT-PCR, PCR anidada y RT-PCR-TR Determinación de la Título reportado: sensibilidad 5x10 de 4.9 la DICT50% técnica en de 20 ml. RT-PCR-TR con la región 500 µl = 100,000 DICT50% UTR3 ARN 20µl = 5,000 DICT50% /1µl Extracción del ARN viral Color Dilución DICT50% 1:10 5x10 3 1:100 5x10 2 1:1,000 5x10 1 Determinación de la 1:10,000 5 sensibilidad de la técnicas de RT-PCR 1:100,000 y PCR anidada con 5x10los -1 genes ORF5 y ORF7 1:1,000,000 5x10-2 C- -

17 Determinación de la sensibilidad de la técnica de RT-PCR-TR Promedios de cuantificación del ARN viral Ensayos ARN viral Diluciones curva ppz6 Diluciones ARN vacunal Diluciones del ARN Promedio Ct D.E. Ct CV% Ct DICT50% No. de moléculas calculadas 1/ x x10 6 1/ x x10 5 1/1, x x10 4 1/10, x10 3 C x x10 2

18 Pruebas de sensibilidad de la RT-PCR, PCR anidada y RT-PCR-TR Determinación de la sensibilidad de la técnica de RT-PCR-TR con la región UTR3 Extracción del ARN Determinación de la sensibilidad de la técnicas de RT-PCR y PCR anidada con los genes ORF5 y ORF7

19 Determinación de la sensibilidad de las técnicas de RT-PCR y PCR anidada ORF 5 DICT 50% RT- PCR PCR anidada 1x10 1 5x x10 2 5x x10 3 5x x x10 5 5x x10 6 5x C Dilución Gel agarosa al 3%, marcador de peso (MP) pbr 322/MspI. En la PCR externa la banda de amplificación se observa en la dilución 10 1, en cuanto a al PCR anidada la banda de amplificación de localizó en la dilución 10 4

20 Determinación de la sensibilidad de las técnicas de RT-PCR y PCR anidada ORF 7 DICT 50% RT- PCR PCR anidada 1x10 1 5x x10 2 5x x10 3 5x x x10 5 5x x10 6 5x C Dilución Gel agarosa al 3%, marcador de peso (MP) pbr 322/MspI. En la PCR externa la banda de amplificación se observa en la dilución 10 2, en cuanto a al PCR anidada la banda de amplificación de localizó en la dilución 10 5

21 Análisis comparativo de la sensibilidad, costos y tiempos, entre RT-PCR, PCR anidada y RT-PCR-TR

22 Análisis comparativo de sensibilidad, costos y tiempos, entre RT-PCR, PCR anidada y RT-PCR-TR Sensibilidad Diluciones del ARN RT-PCR ORF5 PCR Anidada ORF5 RT-PCR ORF7 PCR Anidada ORF7 qrt-pcr UTR3 No. de moléculas qrt-pcr DICT 50% 1x ,730,000 5x10 3 1x ,000 5x10 2 1x ,600 5x10 1 1x , x x10-1 1x x10-2

23 Análisis comparativo de sensibilidad, costos y tiempos, entre RT-PCR, PCR y RT-PCR-TR Costos por reacción Ensayo Reactivo Inversión Precio Costo por reacción Iniciadores - $0.09 RT Fermentas $4, $3.20 Inhibidor $ $1.28 dntp s $2, $1.60 Otros (tubos y agua DEPC) $6, $1.05 $16.93 RT PCR PCR anidada Iniciadores $ $0.01 $1, $5.20 Amplificasa (MgCl, buffer y polimerasa) dntp s $1, $4.00 Otros (tubos y agua) - $0.50 Iniciadores $ $ $2.60 Amplificasa (MgCl, buffer y polimerasa) dntp s - $2.00 Otros (tubos y agua DEPC) - $0.50 Inversión $15, $22.04 Ensayo Reactivo Inversión Costo por reacción Inicadores y $5,344.6 $0.10 sondas (control interno y PRRS) RT PCR TR Amplificasa (MgCl, buffer y polimerasa) $1, $2.60 dntp s $1, $2.00 RT Fermentas $4, $3.20 Inhibidor $ $1.28 Otros (tubos y agua DEPC) $6, $0.56 Inversión $18, $9.73 *Solo se toma en cuenta el costo de los reactivos utilizados para la reacción de PCR

24 Análisis comparativo de sensibilidad, costos y tiempos, entre RT-PCR, PCR y RT-PCR-TR Costos de diagnóstico por muestra Ensayo de RT-PCR Costo Extracción de ARN $29.76 RT $7.22 PCR (muestra y C-) $19.42 Electroforesis y otros ( tubos y agua DEPC) $10.59 Total $66.99 Ensayo de qrt-pcr RT-PCR-TR Extracción de ARN $29.76 $29.76 PCR (por duplicado 6 puntos de la curva y C-) $ RT-PCR (por duplicado muestra y C-) $38.92 $38.92 Total $ $68.68 Ensayo de PCR anidada Costo Extracción de ARN $29.76 RT $7.22 PCR (muestra y C-) $19.42 PCR anidada (muestra y C-) $10.22 Electroforesis y otros ( tubos y agua DEPC) $10.59 Total $77.21 Construcción del control positivo Inversión Costo ppz6 Transformación bacteriana $9, $ Minipreparación $10, $32.58 Purificación $2, $22.00 Cuantificación por PicoGreen $8, $4.27 Secuenciación - $300 Total $29, $ *Se toma en cuenta el costo de la extracción del ARN y la electroforesis

25 Análisis comparativo de sensibilidad, costos y tiempos, entre RT-PCR, PCR y RT-PCR-TR Tiempo Ensayos RT-PCR PCR anidada RT-PCR-TR RT 90 min. 90 min. 30 min. PCR 90 min. 90 min. 120 min. PCR anidada - 90 min. - Electroforesis 60 min. 60 min. - Tiempo 270 min/ 4 hrs 330 min / 5.5 hrs 150 min / 2.3 hrs *No se toma en cuenta el tiempo para la extracción del ARN.

26 DISCUSIÓN El aislamiento viral se considera la prueba de oro para el diagnóstico del PRRSV, sin embargo es laboriosa, costosa y requiere medios de mantenimiento y de cultivo, por tal motivo los métodos basados en PCR son de elección por la especificidad, sensibilidad, rapidez y aplicaciones (OIE 2004). En la qrt-pcr se empleo la región UTR3 para el diagnóstico ya que es la mas conservada en el genoma (Kleiboeker 2005) La amplificación de los genes ORF5 y ORF7 (RT-PCR y PCR anidada) fueron seleccionados por su capacidad de obtener información genética y epidemiológica (Kim, et al. 2013) El amplificación del ORF7 fue más sensible, probablemente por el nivel de expresión del gen. Debido a su menor variabilidad que ORF5, hay menor riesgo de falsos negativos (Toiber 2014).

27 DISCUSIÓN Los ensayos del qrt-pcr (empleando el estándar de cuantificación ppz6) mostraron tener un amplio rango dinámico de cuantificación y ser altamente reproducibles. La DE y el CV del los ensayos del ARN se encontraron dentro de los rangos recomendados (2DV, >30% CV, OIE 2006). El costo por reacción más bajo fue de la RT-PCR-TR, siendo 25 veces menor que el de kits comerciales. El menor tiempo del proceso de diagnóstico fue para la RT-PCR-TR, en comparación con la RT-PCR y PCR anidada, por no requerir procesos posteriores. El ensayo más sensible fue la RT-PCR anidada en un dos pasos, pero es el más laborioso y tardado. El ensayo de RT-PCR anidado en un solo paso, es problemático ya que es común los falsos positivos por contaminación (datos no mostrados) (Trani 2006).

28 CONCLUSIONES La técnica de PCR recomendable para identificar el virus de PRRSV depende de si se desea solo el diagnóstico (cuantitativo o cualitativo), o la recuperación del amplificado para investigación. Para la investigación en un brote de PRRS, la estrategia sería inicialmente tamizar las muestras por PCR TR, posteriormente las muestras positivas se amplificarían por PCR anidada y los productos de amplificación se analizarían por secuenciación de nucleótidos. La RT-PCR-TR además puede aplicarse en la titulación de vacunas, cultivos virales o en experimentos de inmunización desafío.

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