Tipos de Muestras. Técnicas de Biología Molecular. Extracción de ácidos nucleicos. Extracción de DNA genómico. Muestra de sangre en papel filtro
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- César Saavedra Blanco
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1 Técnicas de Biología Molecular Dr. Luis Salazar N Depto. de Ciencias Básicas / UFRO 2004 Tipos de Muestras Extracción de ácidos nucleicos o DNA o RNA Sangre total (EDTA) Saliva Líquido Amniótico Bulbo capilar Tejidos, huesos, dientes Forense Manchas de sangre, líquido seminal y otros materiales Muestra de sangre en papel filtro Extracción de DNA genómico lisis centrif. etanol etanol 70% elución sangre lisado sobrenadante DNA 1
2 Sala de Extracción de DNA CABINA DE SEGURIDAD BIOLÓGICA CABINAS DE SEGURIDAD BIOLÓGICA Evaluación del DNA extraído Espectrofotometría UV Concentración (A260 x factor) Pureza (relación A260/A280) Electroforesis en gel de agarosa Integridad Pureza (contaminación con RNA) Electroforesis de DNA 2
3 Electroforesis de DNA Electroforesis de DNA Electroforesis de DNA Electroforesis de RNA 28 S 18 S NaCl 5 M Nal 6 M Gel de agarosa al 0,8% teñido con bromuro de etídio Electroforesis en gel de agarosa desnaturante Técnicas para análisis de DNA Southern blot Southern blot Hae III PCR Clonación DNA chips Singer & Berg,
4 Southern blot Southern blot- Sondas unilocus Caracterización molecular de resistencia a cloranfenicol en cepas de Shigella flexneri aisladas en niños chilenos con diarrea aguda Southern blot Sondas multilocus Caso de criminalística Si se observan los patrones bandas podrá comprobarse como los perfiles obtenidos en las manchas de sangre encontradas en el sombrero (Hat) y pantalón (Jeans) del sospechoso (S) coinciden con el perfil genético de la víctima (V) Detección del gen cat mediante Southern en cepas de Shigella flexneri Rev. Méd. Chile 2002; 130 (3):
5 Southern blot Polymerase Chain Reaction -PCR Desvantajas Gran cantidad de muestra Ensayo demorado Uso de sondas marcadas con radioisótopos Thomas D. Brock - Yellowstone National Park PCR - Componentes DNA Mg 2+ Taq DNA Polimerasa dctp dgtp dttp datp Partidores (primers) Mezcla de Reacción Termociclador 5
6 PCR - Desnaturación PCR - Alineamiento partidor 2 partidor 1 PCR - Extensión Los iniciadores sirven para dos fines: a. Marcar los extremos del segmento diana, de manera que solamente este segmento será amplificado y no toda la hebra. b. iniciar el proceso de duplicación. partidor 2 Taq DNA Polimerasa partidor 1 Final del primer ciclo Ciclos de la PCR Denaturación Hibridación Final de ciclo Extensión 6
7 Amplificación Exponencial 1 ciclo = 2 Amplicon 2 ciclo = 4 Amplicon 3 ciclo = 8 Amplicon 4 ciclo = 16 Amplicon 5 ciclo = 32 Amplicon 6 ciclo = 64 Amplicon No. No. Ciclos copias FACTORES QUE AFECTAN LA PCR Temperatura y tiempo de denaturación Temperatura de hibridación y diseño del iniciador Tamaño del iniciador Temperatura y tiempo de elongación Tampón Número de ciclos 7 ciclo = 128 Amplicon OPTIMIZACIÓN DE LA PCR Usar iniciadores distantes entre 150 y 250 pares de bases Usar cada iniciador de aproximadamente 20 bp. Cerca de la mitad de las bases en cada iniciador debería ser citocinas y guaninas. Para el control de la técnica es importante amplificar un gen control (ej. α-glucosidasa) en cada muestra, esto demuestra la calidad de la extracción. Idealmente el iniciador control debe amplificar un gen similar en tamaño al gen objetivo. Optimización de la PCR Concentración de ADN Concentración de iniciadores Concentración de cloruro de magnesio Número de ciclos Efecto de la temperatura de alineamiento en la especificidad de la PCR Concentración de ADN RLDL 258 bp ng Rev. Chil. Infectol. 2002; v.19, n.1 7
8 Concentración de iniciadores Concentración de MgCl 2 RLDL RLDL GAPDH nm mm mm Número de Ciclos Amplificación del gen KasA de Mycobacterium tuberculosis de cepas resistentes a Isoniazida (INH) M M RLDL GAPDH Ciclos Ciclos Electroforesis en gel de agarosa al 1% teñido con bromuro de etidio Caracterización molecular de resistencia a cloranfenicol en cepas de Shigella flexneri aisladas en niños chilenos con diarrea aguda Amplificación por PCR del gen meca de cepas de S. Aureus resistentes a meticilina 1003 bp 161 bp Detección del gen cat mediante PCR en cepas de Shigella flexneri Rev. Méd. Chile 2002; 130 (3): Rev. Chil. Infectol. 2001; v.18, n.4 8
9 Inhibiciones en amplificación por PCR Características de la PCR o Alta sensibilidad y especificidad o Menor cantidad de muestra o Reducción del tiempo de ensayo o Riesgos - contaminación Rev. Chil. Infectol. 2002; v.19, n.1 Normas Generales para reducir la contaminación Organización del laboratorio Técnicas de laboratorio adecuadas Importancia de las enzimas en biología molecular Uso de control de reactivos Número de muestras Bioseguridad Importancia de las enzimas en biología molecular Replicación y Transcripción polimerasas ligasas nucleasas quinasas fosfatasas transcriptasa reversa Aplicaciones de las Enzimas de Restricción Tecnología de DNA recombinante clonación de genes Estudio de polimorfismos genéticos Polimorfismo de tamaño de fragmentos de restricción (RFLP) Pesquisa de mutaciones Investigación de enfermedades genéticas 9
10 Importancia de las enzimas en biología molecular Importancia de las enzimas en biología molecular Polimerasas catalizan la síntesis de polimero de ácido nucleico Son fundamentales para clonación y amplificación de genes. Taq DNA polimerasa. Nucleasas hidrolizan la ligación fosfato-diéster de los polimeros de ácidos nucleicos Exonucleasas Endonucleasas - Enzimas de restrición Enzimas de Restricción Reconocen secuencia de DNA específica Degrada DNA extraño mecanismo de protección para bacterias Especie - específica Extremidades generadas asimétricas - sticky end G*AATTC CTTAA*C G AATTC CTTAA C simétricas - blunt end GT*AC GT AC CA*TG CA TG Endonucleasas de Restricción Bam HI Eco RI Hinc II Hind III Kpn I Pvu II Xba I G*GATCC G*AATTC GTY*RAC (Y = C/T, R = A/T) A*AGCTT GGTAC*C CAG*CTG T*CTAGA 10
11 Endonucleasas de Restricción Técnica de RFLP (restriction fragment length polymorphism) Exon 25 Exon 26 Exon 27 DNA ER 1 ER 2 Separación electroforética en gel de agarosa PCR Fragmento amplificado 710 bp Restricción Enzimática XbaI Singer & Berg, 1991 Tamaño del fragmento dirección de la eletrocforesis Tamaño del fragmento 710 bp Genotipo X-X- Genotipo X+X- 710 bp 433 bp 277 bp 433 bp 277 bp Genotipo X+X+ Polimorfismo XbaI del gen de la apob -/- +/- +/- +/+ 710 bp 433 bp 277 bp Gel de agarosa al 1.5% teñido con bromuro de etídio 11
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