PRÁCTICAS DE MICROBIOLOGIA CLINICA
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- María Cristina Río Fernández
- hace 8 años
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1 PRÁCTICAS DE MICROBIOLOGIA CLINICA Juan Carlos Rodríguez Hospital General Universitario de Alicante
2 CASO CLINICO: Rubéola
3 Evolución de los anticuerpos
4 Seroconversión 1º SUERO 1/8 N 2º SUERO 1/256 1/ semanas de intervalo
5 Infección aguda PRESENCIA DE IgM DEMOSTRACION DE SEROCONVERSIÓN
6 CASO CLINICO: HIV Paciente 30 años Ex-ADVP (desde hace 5 años) Asintomático
7 PRUEBA DE CRIBADO: ELISA/EIA
8 PRUEBA CONFIRMATORIA: Western Blot
9 CASO CLINICO: Sospecha de tuberculosis pulmonar Paciente de 25 años Tos, fiebre, expectoración sanguinolenta
10 INFECCION TUBERCULOSA
11 INFECCION TUBERCULOSA: Mantoux o tuberculina
12 INFECCION TUBERCULOSA: IGRA (QUANTIFERON)
13 ENFERMEDAD TUBERCULOSA: TINCION
14 ENFERMEDAD TUBERCULOSA: CULTIVO
15 ENFERMEDAD TUBERCULOSA: PCR
16 CASO CLINICO: Toxoplasmosis Mujer embarazada IgG positiva a T. gondii Asintomática
17 Toxoplasmosis
18 CASO CLINICO: Viaje al trópico Cooperante Regreso hace 5 días de Camerún Fiebre
19 MALARIA
20 MALARIA
21 MALARIA
22 HEPATITIS HAV HBV HCV HDV HEV CMV, EBV, Toxoplasma, etc.
23 HEPATITIS B Actividad viral HBsAg HBeAg AntiHBc (IgM) Infección natural AntiHBc Buen pronóstico AntiHBs AntiHBe
24 HEPATITIS B H. aguda H. curada Portador Mutante precore H. crónica
25 HEPATITIS B
26 HEPATITIS B
27 HEPATITIS C Cribado: ELISA Confirmación: Western Blot PCR Genotipado: 1 (1a, 1b) 3 (3a)
28 HEPATITIS D
29 FUNDAMENTOS BASICOS DE MICROBIOLOGIA MOLECULAR
30 FUNDAMENTOS TEORICOS Las técnicas llamadas de microbiología molecular tratan de estudiar el genoma mediante varias metodologías: PCR convencional PCR a tiempo real (real time PCR) Secuenciación Análisis de fragmentos genómicos
31 FUNDAMENTOS TEORICOS La secuencia de bases (adenina, guanina, citosina y timina) codifican la información genética Cuando el gen se expresa, se sintetiza RNA y a partir de él se sintetizan las proteínas Todos los organismos secuenciados están recogidos en una base de datos de acceso público llamada GenBank (pubmed) El programa que está instalado en esa base de datos tiene instalada diversas aplicaciones que son muy interesantes en este tipo de estudios. Otros programas interesantes son: Chromas: analiza secuencias Primer express: Diseña sistemas de PCR a tiempo real Primer 3: Diseña sistemas de PCR convencional
32 EXTRACCION DE DNA OBJETIVO Romper la bacteria y separar el DNA del resto de sus componentes En función de la cantidad de DNA que dispongamos se utilizan diferentes métodos METODOS Mucha cantidad de DNA (cultivo bacteriano): Chelex Poca cantidad de DNA (muestra clínica): Columnas (Quiagen) TNAI (Roche)
33 PCR convencional REACTIVOS Buffer Cloruro de magnesio: Entre 1,5 y 3 mm dntp: A, G, C, T Cebadores o primers Taq polimerasa Agua DNA diana
34 PCR convencional PARAMETROS DEL TERMOCICLADOR Apertura de las hebras de DNA: 94ºC Hibridación de los cebadores: Temperatura variable Elongación de las cadenas: 72ºC Número de ciclos: Entre 30 y 40
35 PCR convencional DETECCION DE LA AMPLIFICACION Preparación del gel de agarosa Electroforesis a 100 V Visualización con bromuro de etidio ojo, es cancerígeno!!!!
36 PCR a tiempo real REACTIVOS Master mix Cebadores o primers Sonda Agua DNA diana
37 PCR a tiempo real
38 PCR a tiempo real DETECCION DE LA AMPLIFICACION
39 SECUENCIACION REACTIVOS 1ª REACCION Taq gold Cebadores o primers Agua DNA diana DETECCION DE LA AMPLIFICACION Preparación del gel de agarosa Electroforesis a 100 V Visualización con bromuro de etidio ojo, es cancerígeno!!!! ELIMINACION DE CEBADORES Y OTROS FRAGMENTOS PEQUEÑOS DE DNA Tratamiento con enzima específico
40 SECUENCIACION REACTIVOS 2ª REACCION Mezcla de secuenciación Un solo cebador diluido Agua Amplificado de la primera amplificación DETECCION DE LA SECUENCIACION Preparación de la muestra Envío a la UMH
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