Reacción en cadena de la polymerasa (PCR)

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1 Reacción en cadena de la polymerasa (PCR) 1

2 PCR Que es? Es una técnica in vitro diseñada para amplificar una región específica de DNA. Es extremadamente sensible, con la capacidad de amplificar millones de veces cantidades minúsculas de DNA, en un período de tiempo relativamente corto. 2

3 Ventajas de la PCR Velocidad (2 a 4 horas, dependiendo del tamaño a amplificar). Facilidad de uso. Sensibilidad (es necesario muy poco DNA). No es necesaria una alta pureza del DNA (ej. Colony PCR). 3

4 Desventajas de la PCR Información de secuencia a amplificar (en general). Tamaño de amplificación limitado (25 kb en casos especiales). Infidelidad de la amplificación (errores de la enzima). Al ser tan sensible debe tenerse cuidado con posibles contaminaciones. 4

5 Requerimientos para una PCR En la reacción Muestra (templado o molde: DNA o cdna) Primers DNA polymerasa resistente a alta temperatura Mg ++ Deoxynucleótidos trifosfatos dntps (datp, dgtp,dctp, dttp) Buffer, KCl Termociclador instrumento programado para cambiar la temperatura de las muestras rápidamente desde una temperatura a otra. 5

6 En detalle Templado o molde Necesario: Muy poco (1 μg de humano, 10 ng de levadura, 1 ng de bacteriano o 1 pg of plasmídico) Es importante que el molde no compita con los primers en el annealing, que puede ocurrir por excesivo templado inicial. 6

7 Primers Deben: tener una longitud de entre 18 y 25 nt. tener un contenido de G+C entre 40-60% ser complementarios a hebras opuestas en el templado. Primer forward (fw) o sense (se) Primer reverse (rev) o antisense (as) 7

8 Primers (cont.) Deben evitar ser complementarios entre si y con su par de amplificación (no formar dímeros de primers, especialmente en el 3 ) PCR Dímero de primer 8

9 Primers (cont.) Deben evitar formar estructuras secundarias (especialmente el 3 ). 5 3 PCR

10 Primers (cont.) Tm similares, entre 55 y 75 ºC. 50 % Tm = 2(A + T) + 4(G + C) ºC presentes en exceso ( μm cada uno) para favorecer el annealing entre el molde y el primer. ser específicos para la secuencia a amplificar. en general se busca que tengan una C o G en el 3, el 5 no importa tanto en el annealing (pueden llevar sitios de corte para enzimas de restricción o colas largas). 10

11 Dna polimerasa termo-resistente 1-2 unidades de enzima /100 μl de reacción Características principales a considerar al elegir la enzima: Procesividad Fidelidad Taq DNA polymerasa: Aislada de Thermus aquaticus (vive en aguas termales). No tiene proofreading: 3-5 exonucleasa (comete un error cada nt) Deja overhangs de A en el 3 (permite clonado desde la PCR). Pfu DNA polymerasa: Aislada de Pyrococcus furiosus (también vive en aguas termales). Posee proofreading: 3-5 exonucleasa (comete un error cada nt). Deja extremos romos. 11

12 Mg ++ (MgCl2, MgSO4) Mg ++ es un cofactor de DNA polimerasas, debe estar libre para actuar como cofactor de la polimerasa. Determinar la [Mg ++ ] óptima es uno de los pasos más importantes en la puesta a punto de una PCR. Muy poco la polimerasa no funciona correctamente, afectando el rendimiento de la reacción Mucho favorece el annealing de los primers a lugares que no son 100 % complementarios, afectando la especificidad de la reacción 12

13 dntps Deben estar presentes en cantidad suficiente para que se logre la extensión a lo largo de todos los ciclos (~200 μm cada dntp). No deben estar en exceso para que los iones Mg ++ no estén acomplejados a estos y no disponibles como cofactores para la enzima. En ambos casos se afecta el rendimiento de la reacción. 13

14 Buffer El buffer es en general Tris base ajustado a un ph específico con HCl. ph 8.3 es el óptimo para Taq. El ph óptimo mantiene la enzima plegada en una conformación a la cual es enzimaticamente activa. KCl: contribuye al plegamiento correcto de la enzima, por lo tanto a la correcta actividad de esta. 14

15 Etapas en una PCR Hay 3 etapas básicas en una PCR 1. Desnaturalización del DNA (~ 94º C) por 1 min. 2. Annealing (~ Tm primers 5º C) por 30 seg. 3. Extensión (72º C) 1 min/kb a amplificar Programa de PCR: 1-5 min a 94º 1 min a 94º 30 seg a Tm 5º 1 min/kb a 72º x 35 ciclos 10 min a 72º Generalmente se agrega un paso inicial a 94º C por 1 a 5 minutos, y un paso final a 72º C por 5-10 minutos. 15

16 Amplificación exponencial 1º ciclo 2 moléculas DNA doble cadena Cuántas copias se pueden sintetizar? 2º ciclo 4 moléculas DNA doble cadena 3º ciclo 8 moléculas DNA doble cadena (solo 2 amplicones) 2 n copias donde n = # de ciclos de PCR Para 30 ciclos = 1,073,741,824 copias Asumiendo que se empieza con una sola molécula de molde, pero en general se usan cientos o miles (calculen). 16

17 En la vida real esto no es tan así DNA amplificado ciclos Al final de la PCR se llega a un plateau. La enzima va perdiendo actividad. 17

18 Controles de PCR Control Sin templado: no debe haber producto; de no ser así hay DNA contaminante en algún reactivo, o no hubo cuidado al pipetear. Control positivo (si lo hay): debería haber producto, muestra que todos los reactivos funcionan y como debería verse el producto. Control de primers: se usa molde pero se agrega uno u otro primer (se hace para los dos). Muestra que no haya amplificación con solo uno de los primers. Si hay, el primer se une a lugares no específicos. 18

19 Como se pipetea una PCR? Para una misma reacción, con solo uno de los reactivos que cambia, se hace una Mix. Mix = cantidad de cada uno de los reactivos por PCR X (# de PCRs) +1 Ejemplo para una PCR de 20 tubos donde solo varía el molde: 1X 21X Buffer 2 μl 42 μl Mg++ 1,2 μl 25,2 μl dntps 0,4 μl 8,4 μl Primer 1 1 μl 21 μl Primer 2 1 μl 21 μl Taq 1 μl 21 μl Molde 1 μl - H2O 12,4 μl 260,4 μl Se pipetea la mix en un tubo, se alicuota en los tubos de reacción, y luego se agrega el molde. 19

20 Como se pipetea una PCR? En general siempre se pipetea lo menos costoso primero (en este caso el agua) En el laboratorio deben usarse pipetas destinadas a PCR, tips con filtro y lugares distintos para el pipeteo de reactivos y templados. Por lo general siempre se pipetea el molde al final, de manera de evitar la contaminación y que la enzima pueda empezar a amplificar 20

21 Hot Start PCR Evita la actividad de la enzima a temp. amb. (inespecificidad). Agregado de la enzima en el termociclador a 94º C. Las Taq más top vienen con un anticuerpo unido que les impide amplificar. En el termociclador, el anticuerpo se desnaturaliza a 94º C (la enzima no) y ahora tiene actividad. 21

22 Variaciones de PCR Nested PCR: A veces una PCR no da un producto único, sino que da un chorreado. Para afinar la amplificación se puede usar un segundo par de primers que hibriden más internamente que los primeros, y el chorreado de la primera PCR como molde. Heminested PCR: Se usa un solo primer nuevo que hibrida más internamente en pareja con uno de los primeros primers usados, y el chorreado de la primera PCR como molde. 22

23 Variaciones de PCR RT-PCR: PCR sobre producto de Transcriptasa Reversa Requiere primer antisense y una DNA polimerasa dependendiente de RNA. En general se usa para detectar mrnas específicos, conocer secuencias nuevas de RNA, amplificar cdnas que provienen de cantidades mínimas de RNA (y cuantificarlos), clonar ORFs eucarióticos, etc. 23

24 Aplicaciones de PCR Rastreo de clones Clonado por PCR Mutagénesis dirigida Diagnóstico de enfermedades Detección de organismos infecciosos Medicina forense y determinación de paternidad; Fingerprinting (AFLPs, RAPD) Cuantificación de mrna (PCR en Tiempo Real) 24

25 Colony PCR Picar colonias al azar MIX Colonias sobrevivientes de la selección Tubos de reacción de PCR 1. Termociclador 2. Análisis de productos en gel de agarosa con bromuro de etidio Inocular cultivos de LB + ampicilina Incubar ON a 37ºC y agitación 25

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