Reacción en cadena de la polimerasa (PCR)

Transcripción

1 Dr. Alejandro Leal Reacción en cadena de la polimerasa (PCR) La reacción en cadena de la polimerasa (PCR, por sus siglas en inglés de "polymerase chain reaction") es un método de amplificación in vitro de segmentos de ADN que fue ideado por Kary Mullis a mediados de la década de los 80. Desde entonces el análisis de la base molecular de la variación biológica a nivel del material genético se ha facilitado enormemente, pues sin necesidad de pasos previos de clonación, se pueden obtener cantidades de ADN de una región específica del genoma a partir de una disolución compleja de ADN para su posterior caracterización por diversos métodos. Antes de la PCR, la obtención de cantidades suficientes de una región específica del genoma involucraba una serie de pasos previos: 1. la formación de bibliotecas genómicas: cortar el ADN del genoma en cuestión, introducir los segmentos resultantes en vectores de clonación - plásmidos o virus modificados- que servían para transformar bacterias en las que estos se multiplican, 2. tamizaje de la biblioteca genómica en búsqueda de la región de interés con sondas -segmentos de ADN obtenidos previamente mediante diversos métodos, cuya secuencia sirve para "pescar" a su región de secuencia homóloga o complementaria -hibridar-, de entre el resto de secuencias presentes en la biblioteca, 3. Clonar el segmento: tomar muestras de la colonia que contiene el segmento de interés y multiplicarla en el medio de cultivo adecuado, de esta forma se hacen múltiples copias -clonación- del segmento, 4. Purificar el segmento: separar el ADN del vector del ADN de la bacteria y luego escindir el fragmento de interés del vector y purificarlo. Cada uno de los pasos anteriores es muy laborioso y requiere de la adquisición de destrezas de quien los efectúa. Es importante recalcar, que estos pasos son aún la base del análisis molecular de cualquier especie, pues es a partir de ellos que se logra el conocimiento básico sobre las secuencias de las diferentes regiones del genoma, lo que es la base de la PCR. La ventaja de la PCR radica en que una vez que se conoce la secuencia de la región de interés se prescinde de posteriores pasos de clonación. La PCR se basa en ciertas características de la duplicación in vivo del ADN; la primera es que la síntesis de nuevas cadenas de ADN es un proceso catalizado enzimáticamente por la ADN polimerasa y la segunda es la necesidad de la ADN polimerasa de iniciadores (primers) para que se pueda ligar a la hebra de ADN que le servirá de base o molde para sintetizar la nueva hebra. Este requerimiento es el

2 que se explota para lograr la síntesis específica de un segmento determinado del genoma a partir de una disolución de ADN extraído directamente de las células. Si se conoce la secuencia de la región de interés, se pueden sintetizar estos iniciadores y luego en repetidos ciclos de amplificación, aumentar exponencialmente el número de copias de la región, pues cada copia recién sintetizada, sirve de molde para la síntesis de otra en el ciclo siguiente. Para ejemplificar este hecho, supóngase que se empieza a amplificar un segmento a partir de una sola molécula de ADN, esto es, de dos hebras. La PCR se desarrolla en tres pasos: 1. Desnaturalización de la doble hélice, esto es separación de las dos hebras mediante el rompimiento de los puentes de hidrógeno que las mantiene unidas, lo que se logra calentando al ADN de doble banda hasta alcanzar temperaturas superiores a los 90ºC. 2. Alineamiento de los iniciadores diseñados para la región de interés. Para lo cual, la temperatura se baja a una que sea óptima para que los iniciadores hibriden con sus regiones homólogas. Los iniciadores se diseñan en pares ya que ambas hebras deben servir como moldes para la síntesis. 3. Extensión o síntesis por polimerización de las nuevas moléculas. La temperatura se aumenta para despegar iniciadores hibridados con regiones de homología parcial de la secuencia, dejando unidos sólo aquéllos con homología absoluta y permitir que la polimerasa catalice la reacción de síntesis del nuevo segmento. En este punto, se termina con dos copias del segmento, la que sirvió como base de la síntesis y la recién sintetizada y a su vez, nuevos sitios para que se coloque el iniciador son generados con cada cadena de ADN nueva. El ciclo se repite con el doble de moléculas base que en el anterior, por lo que al final del mismo se tienen cuatro copias. Si el proceso se repite por tercera vez, al final se obtienen ocho copias y así sucesivamente. Al cabo de n ciclos se tienen 2 n copias del segmento de interés a partir de una única doble hélice de ADN; entonces, luego de 10 ciclos se tienen copias, de 15 ciclos copias, al cabo de 20 ciclos copias, etc. Las amplificaciones se llevan a cabo en un tubo de polipropileno, de los llamados tubos Eppendorf, al que se adicionan los componentes esenciales para la reacción: ADN molde, iniciadores, ADN-polimerasa de Thermus aquaticus (Taq polimerasa), los cuatro desoxirribonuleótidos trifosfato (dntps), Mg +2 y la solución amortiguadora (buffer) apropiada, todo en solución acuosa. El tubo se coloca en un termociclador, un aparato programable que controla la temperatura, la duración de los pasos y el número de ciclos de amplificación.

3 Fig. 1. Esquema de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) Como se puede inferir de lo anterior, la técnica es muy sensible, permite amplificar secuencias específicas a partir de muy poco material inicial. Estas características hacen que la PCR tenga múltiples aplicaciones en diversos campos, aparte de la biología molecular, como el forense, la arqueología, la infectología, etc.. Se puede usar para diagnosticar la presencia de un virus o bacteria en un tejido, para identificar el origen de una muestra, p.ej. pelo o semen, en casos de delitos, identificar la especie de la que proviene un determinado tejido, para monitorear la terapia en algunos tipos de cáncer, efectuar análisis de ligamiento para encontrar genes en el mapa genómico, estudiar evolución molecular, determinar la contaminación de alimentos o agua, etc. Entre las demostraciones más espectaculares del poder de esta técnica está el haber servido para identificar molecularmente una planta de magnolia, del Mioceno. Con PCR se amplificaron y luego se analizaron en detalle genes de 18 millones de años de edad. También se han podido estudiar las relaciones evolutivas de mamuts congelados, momias, restos del hombre de Neandertal etc. En esta práctica se montará una reacción de PCR, se mostrará cómo funciona un termociclador y se analizarán algunos resultados de la aplicación de esta técnica.

4 En la presenta práctica se determinará el genotipo de cada estudiante para la inserción polimórfica de un elemento Alu Amplificación de inserción polimórfica de Alu Una gran porción de los genomas eucarióticos está formada por secuencias de ADN repetitivo que se encuentran dispersas por todo el genoma. Muchas de ellas son secuencias transponibles, secuencias móviles que pueden moverse a otras localizaciones dentro del genoma. Algunas de estas secuencias son las conocidas como SINEs y LINEs. Estas secuencias representan una parte importante del genoma humano (alrededor de un 10%) y se caracterizan por estar formadas por una mezcla del 70 por ciento de secuencias únicas y del 30 por ciento de secuencias repetitivas. El grupo de los elementos dispersos largos o LINEs representa una categoría de secuencias de ADN repetitivas transponibles. En humanos, el ejemplo más destacado es el de la familia L1. Los miembros de esta familia tienen unos 6400pb de longitud y se estima que hay hasta en el genoma. El mecanismo de transposición de estos elementos es muy similar al de los retrovirus (depende de la acción de la transcriptasa reversa), razón por la cual se les llama retrotransposones. Los elementos dispersos cortos, SINE por sus siglas en inglés (short interspersed elements) tienen menos de 500pb de longitud. En un genoma humano se pueden encontrar o más. Los SINEs humanos mejor caracterizados son un conjunto de secuencias muy relacionadas denominadas familia Alu (el nombre se debe a la presencia de sitios de restricción para la endonucleasa AluI). Los miembros de esta familia, que también se encuentran en otros mamíferos, tienen entre 200 y 300pb de longitud y se encuentran dispersos bastante uniformemente por todo el genoma, tanto entre genes como dentro de ellos. En humanos, esta familia comprende más del 5% del genoma completo. Los genes en eucariotas están compuestos por exones e intrones. Los exones constituyen las regiones codificantes de un gen, que codifican para productos con funciones importantes. Por esta razón, las secuencias exónicas varían poco entre individuos. Por el contrario, los intrones (segmentos del gen que son eliminados por splicing y no llegan a salir del núcleo) varían a menudo entre individuos, tanto en tamaño como en secuencia. Son las secuencias no codificantes como las regiones entre genes y los intrones, que permiten estudiar la diversidad genética entre individuos y son la base de la identificación de individuos (por ejemplo pruebas de paternidad) y la genética de poblaciones.

5 Esta práctica consiste en un tamizaje sencillo basado en la técnica de PCR para la detección de una secuencia Alu dentro del locus PV92, en el cromosoma 16. Esta inserción de Alu está ubicada en un intrón y es dimórfica (presente en algunos individuos y en otros no, Figura 3). Algunas personas tienen la inserción en el locus PV92 en uno de sus dos cromosomas 16, otros la tienen en ambos homólogos, y algunos no la tienen en ninguno. La presencia o ausencia de la inserción se detecta por una reacción de PCR, seguida de electroforesis en un gel de agarosa. En esta práctica los estudiantes aislarán su propio ADN genómico. Utilizarán iniciadores que flanquean la inserción Alu (de 300pb) y 641pb del locus PV92. Como resultado los alelos con la inserción generarán un producto de 941pb y los alelos sin la inserción un fragmento de 641pb. La electroforesis de los productos en un gel de agarosa permite distinguir los tres genotipos posibles (+/+, +/-. -/-). Fig. 3. La presencia o ausencia de la inserción Alu en el locus PV92 del cromosoma 16

6 Procedimiento Lección 1: Extracción de ADN

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9 Lección 2: Amplificación por PCR