Detección de la secuencia Alu mediante la técnica Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR ) N. Rodríguez

Transcripción

1 Detección de la secuencia Alu mediante la técnica Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR ) N. Rodríguez 1

2 Objetivos Entender la técnica: Reacción de Polimerasa en Cadena (PCR por sus siglas en inglés) Definir el concepto PCR y sus aplicaciones en la investigación y los procesos biológicos Extraer, amplificar y analizar muestras de DNA de tejido bucal Entender qué es Genética Poblacional y los principios que cobijan la teoría Hardy- Weinberg 2

3 Objetivos Calcular las frecuencias alélicas y genotípicas de las muestras de cada sección Analizar e interpretar los resultados 3

4 Reacción de Polimerasa en Cadena Qué es PCR? Qué se necesita? Cómo trabaja? Qué estamos amplificando? 4

5 Qué es PCR? Replicación del DNA en un microtubo! Hacer muchas copias de una secuencia partiendo de un molde o templado Utiliza enzima resistente a altas temperaturas- Taq-Polymerasa 5

6 PCR Temperatura Melting 95 o C 0 Tiempo 6

7 PCR Temperatura Melting 95 o C 0 Tiempo Calor 7

8 PCR Temperatura Melting 95 o C Annealing Primers 58 o C Extension 72 o C Melting 95 o C 0 Tiempo 8

9 Temperatura Melting 95 o C PCR Annealing Primers 58 o C Extension 72 o C Melting 95 o C 30x 0 Tiempo Calor Calor 9

10 PCR Temperatura Melting 95 o C Annealing Primers 58 o C Extension 72 o C Melting 95 o C 30x 0 Tiempo 10

11 Temperatura Melting 95 o C PCR Annealing Primers 58 o C Extension 72 o C Melting 95 o C 30x 0 Tiempo Calor Calor 11

12 PCR Temperatura Melting 95 o C Annealing Primers 58 o C Extension 72 o C Melting 95 o C 30x 0 Tiempo 12

13 PCR Temperatura Melting 95 o C Annealing Primers 58 o C Extension 72 o C Melting 95 o C 30x 0 Tiempo Fragmentos de largo definido 13

14 DNA se replica Copias Número de Ciclos

15 Perkin Elmer GeneAmp 2400 Thermal Cycler PCR 15

16 Electroforesis de Productos de PCR Homocigótico para la ausencia de Alu Homocigótico para la presencia de Alu Heterocigótico 16

17 Qué se necesita para llevar a cabo PCR? Templado de interés Iniciadores (primers) de secuencia específica que flanqueen la secuencia del templado de interés è Forward (upstream) ç Reverse (downstream) Nucleótidos (datp, dctp, dgtp, dttp) MgCl 2 (cofactor enzima) Amortiguador Taq Polimerasa 17

18 Cómo trabaja el PCR? Calor (95 o C) para desnaturar las cadenas de DNA Enfriar (58 o C) para pegar los primers al templado Calor (72 o C) para activar la Taq-Polimerasa, encargada de extender los primers Repetir ciclos: 95 C - 1 minutos 58 C - 30 segundos 72 C - 30 segundos 18

19 Desnaturando el templado Las altas temperatura permite la separación de las cadenas de DNA 95 o C 19

20 Hibridización de los iniciadores (primers) Iniciadores hibridizan con el templado Taq Polimerasa reconoce la doble cadena 58 o C 20

21 Diseño de los iniciadores (primers) El contenido en G + C debe ser aproximadamente del 50%. La relación máxima de purinas/pirimidinas será 60%/40%. Evitar zonas con largas secuencias de una sóla base. Tamaño: se recomienda de 18-30pb. La temperatura de hibridización de los iniciadores debe ser similar en ambos y será variable en función de la secuencia de los mismos. Generalmente oscila entre los 45 y 60 C. Tm=4 (G +C) +2 (A+T) 21

22 Sales KCl- Influye en la desnaturalización del DNA. Altas concentraciones de K + favorece la desnaturalización de secuencias cortas de DNA. Bajas concentraciones de K + ayudan en la desnaturalización de secuencias largas. MgCl 2 - Aumenta la temperatura de hibridización del DNA. Altas concentraciones de Mg ++ disminuyen la especificidad de la reacción. Bajas concentraciones de Mg ++ aumentan la especificidad de la reacción. 22

23 Extensión Taq Polimerasa extiende los iniciadores Se sintetiza de una cadena sencilla (produciendo un fragmento doble por la complementaridad) en la dirección 72 o C Repetir 30 veces: desnaturación, hibridización, y extensión 23

24 El producto amplificado se logra a partir del tercer ciclo Ciclo 1 Ciclo 2 Ciclo

25 Secuencia de interés Cromosoma 8 Intron en el gen TPA (tissue plasminogen activator) Alu-TPA25 Amplified Region Exon 8 Alu Exon 9 Exon 10 Intron 8 25

26 Alu-TPA25 No está asociado a ningún desorden o enfermedad La familia de elementos Alu consiste de secuencias repetitivas ( pb) que se repiten a lo largo del genoma. Estos elementos derivan su nombre por el lugar de reconocimiento que tiene la enzima Alu I. Amplified Region Exon 8 Alu Exon 9 Exon 10 Intron 8 26

27 Secuencias Alu Cada secuencia Alu está flanqueada por direct repeats Surgen como resultado de retrotransposiciones. Occurre ~300,000 veces en el genoma humano Amplified Region Exon 8 Alu Exon 9 Exon 10 Intron 8 27

28 Significado evolutivo Alu-TPA 25 Secuencias altamente conservadas Se insertó hace 1,000,000 años Dimorfismo (+/+, +/-, -/- ) Utilizado en genética poblacional, pruebas forenses y análisis de paternidad 28

29 Procedimiento Extracción del DNA genómico v Chelex (resina de intercambio iónico) enlaza MgCl 2 v 56 o C libera el tejido conectivo e inactiva las DNasas v 100 o C Rompe la membrana celular y desnatura las proteínas 29

30 Extracción de ADN Membrana celular Membrana nuclear DNA genómico Mg ++ Mg ++ Mg ++ Calor rompe la membrana Mg ++ Mg Mg La resina Chelex enlaza los iones de Mg ++ 30

31 Preparación de la reacción de PCR Asegurarse de no transferir la resina Mezclar bien el DNA templado junto a los primers y el bead El bead contiene: Taq-Polimerasa, amortiguador, dntps, MgCl 2 Programa máquina PCR: 95ºC 5 minutos 95ºC 1 minuto 58ºC 30 segundos 72ºC 30 segundos 4ºC 30 ciclos 31

32 Resultados. La inserción es dimórfica. Esto significa que puede estar presente en unos individuos y en otros no. Productos: fragmento 400 bp fragmento 100 bp Existen tres posibles genotipos: +/+, -/-, +/- Amplified Region Exon 8 Alu Exon 9 Exon 10 Intron 8 32

33 Resultados Alu-PCR Marcador 100pb 400pb 100pb +/+ +/- -/- 33

34 Para estimar la frecuencia de Alu en la población v Amplificar la región Alu de una muestra representativa de una población v Calcular la frecuencia genotípica observada y la frecuencia alélica 34

35 Alu y Genética Poblacional Equilibrio Hardy-Weinberg p 2 + 2pq + q 2 = 1 p q p pp pq q pq qq +/+ = p 2 +/- = 2pq -/- = q 2 35

36 Calcular la Frecuencia Genotípica Observada Genotipo +/+ (p 2 ) +/- (2pq) -/- (q 2 ) Total (N) # de individuos Frecuencia observada 36

37 Calcular la frecuencia alélica observada Frecuencia de p = número de alelos p (+) = total alelos Frecuencia de q = número de alelos q (-) = total alelos 37

38 Frecuencias genotípicas de una muestra al azar de una población Genotipo # de cada genotipo Frecuencia +/ / / Total 10, Calcular las frecuencias alélicas para toda la población. Serán las frecuencias alélicas y genotípicas de la clase similares a las de la población? Qué prueba estadística debemos utilizar? 38

39 Equilibrio Hardy-Weinberg Determinar frecuencia genotípica esperada p 2, 2pq y q 2 Ejemplo: Si p = 0.45, entonces q = 0.55 ya que p + q = 1 p 2 + 2pq + q 2 = 1 (0.45) (0.45)(0.55) + (0.55) 2 = = 1 p2 = pq = 0.50 q2 = 0.30 Representa las frecuencias genotípicas esperadas si la población está en equilibrio genético. 39

40 Calcular el número de genotipos Calcular la frecuencia genotípica esperada para la clase presumiendo que la población está en equilibrio genético Calcular el # de genotipos esperados. Qué prueba estadística podemos usar para determinar si la población se encuentra en equilibrio? 40

41 Prueba χ 2 2 χ ( O E) = E 2 Observados Esperados (O-E) 2 /E Clase +/+ +/- -/- Observados Esperados (O-E) 2 /E Población +/+ +/- -/- 41