Reacción en cadena de la Polimerasa (PCR)

Transcripción

1 Explicación de TP Nº 2 Reacción en cadena de la Polimerasa (PCR) Química Biológica Patológica Dra. Mariana L. Ferramola Dra. Gabriela Lacoste 2015

2 Definición de PCR Es la amplificación enzimática de un fragmento de interés (ADN) localizado entre dos oligonucleótidos (cebadores). Permite generar cantidades ilimitadas de una secuencia de interés.

3 Componentes del sistema de PCR ADN molde Oligonucleótidos (cebadores o primers) Máster Mix Polimerasa termoestable Solución buffer MgCl 2 dntps (datp; dctp; dttp; dgtp) H 2 O

4 Componentes del sistema de PCR: ADN molde El ADN molde puede ser de cadena sencilla o doble, circular o lineal. En caso de desear amplificar una secuencia de ARN se debe utilizar primeramente una transcriptasa reversa. Deben tenerse en cuenta los posibles contaminantes presentes en el ADN molde (CALIDAD), que pudieran disminuir la eficiencia de reacción: Urea SDS Acetato desodio Agarosa Fenol La CANTIDAD de ADN molde a utilizar depende de la muestra de partida. Demasiada cantidad de ADN puede inhibir la reacción de PCR.

5 Componentes del sistema de PCR: ADN molde

6 Componentes del sistema de PCR: cebadores EldiseñodelosprimersparaunaPCResFUNDAMENTAL. SonlosquedelimitanlazonadeADNaamplificaryporlotantolaespecificidad. Son los puntos de arranque de la Taq polimerasa, proveen los extremos 3 -OH libres. CARACTERISTICAS Longitud Especificidad Temperatura de Hibridación Complementariedad de secuencias Contendido GC

7 Componentes del sistema de PCR: cebadores ESPECIFICIDAD Reconocer una SECUENCIA UNICA dentro del ADN templado Especificidad de un primer depende de la LONGITUD del mismo. SECUENCIA CORRECTA!! (A) (B) (C) (D)

8 Componentes del sistema de PCR: cebadores Forward ATGGGAGAACTGGAGCCTTC 5 3 Reverse OJO!!!! TTGGCTCCATATTCAATCGGT 5 3 AACCGAGGTATAAGTTAGCCA 3 5 ACCGATTGAATATGGAGCCAA 5 3 ORIGIN 901 gcagagtacc tgaaacagga agtattttaa atattttgaa tcaaatgagt taatagaatc 961 tttacaaata agaatataca cttctgctta ggatgataat tggaggcaag tgaatcctga 1021 gcgtgatttg ataatgacct aataatgatg ggttttattt ccagacttca cttctaatga 1081 tgattatggg agaactggag ccttcagagg gtaaaattaa gcacagtgga agaatttcat 1141 tctgttctca gttttcctgg attatgcctg gcaccattaa agaaaatatc atctttggtg 1201 tttcctatga tgaatataga tacagaagcg tcatcaaagc atgccaacta gaagaggtaa 1261 gaaactatgt gaaaactttt tgattatgca tatgaaccct tcacactacc caaattatat 1321 atttggctcc atattcaatc ggttagtcta catatattta tgtttcctct atgggtaagc 1381 tactgtgaat ggatcaatta ataaaacaca tgacctatgc tttaagaagc ttgcaaacac 1441 atgaaataaa tgcaatttat tttttaaata atgggttcat ttgatcacaa taaatgcatt 1501 ttatgaaatg gtgagaattt tgttcactca ttagtgagac aaacgtcctc aatggttatt 1561 tatatggcat gcatataagt gatatgtggt atctttttaa aagataccac aaaatatgca

9 LONGITUD Componentes del sistema de PCR: cebadores La longitud de la secuencia es fundamental para la asociación ESPECIFICIDAD Por ejemplo: Hay una probabilidad de ¼ (4-1 ) de encontrar una A, G, C o T en una secuencia dada. Hay una probabilidad de 1/16 (4-2 ) de encontrar una secuencia de dinucleótidos. Hay una probabilidad de 1/256 (4-4 ) de encontrar una secuencia de tetranucleótidos. Si tenemos una secuencia de 17 pb, estadísticamente, esta estará presente unavez cada4-17 basesoaproximadamente 17billonesdebases. LONGITUD IDEAL: nt Muy largos: fallas en el annealing bajo rendimiento

10 Componentes del sistema de PCR: cebadores TEMPERATURA DE ANNEALING Depende de la LONGITUD y la COMPOSICION del primer. T annealing depende de la Temperatura de melting o fusión (Tm) de los primers. Tm= temperatura a la cual la mitad de las moléculas de primer están apareadas con el ADN molde. Los primers no deben tener T a muy diferentes entre si (no mas de5 C). T annealing: 5 C por debajo del Tm más bajo del par de primers(t a=al menos 50 C) T annealing BAJO RENDIMIENTO O NO AMPLIFICACION OPTIMA INESPECIFICIDAD

11 Componentes del sistema de PCR: cebadores COMPOSICION DEL PRIMER 40-60% CONTENIDO GC Asegura launiónestableentreel primer y el ADNtemplado COMPLEMENTARIEDAD DE SECUENCIAS INTRA-PRIMER: el primer se pliega sobre si mismo en una estructura doble cadena (interfiere con el annealing al ADN templado). INTER-PRIMER: Formación de dímeros disminuye la formación de producto por competencia

12 Componentes del sistema de PCR: polimerasa termoestable Las ADN polimerasas termoestables presentan las siguientes características: Polimerizan en dirección 5 3. Necesitan de un extremo 3 -OH libre para comenzar la polimerización. Incorporan dntps por complementariedad en una cadena que sirve de molde. NecesitanlapresenciadeMg 2+ parafuncionar. Son capaces de resistir altas temperaturas por períodos considerables.

13 Componentes del sistema de PCR: polimerasa termoestable Existe una variedad de enzimas con características diferentes, según la finalidad de la PCR a realizar. ADN polimerasa Vida media (95ºC) A) B) C) Taq(Thermus aquaticus) Vent(Thermococcus litoralis) Pfu(Pyrococcus furiosus) Tth(Thermus thermophilus) A) AcIvidad exonucleasa 5 3. B) AcIvidad exonucleasa 3 5. C) Actividad de transcriptasa inversa.

14 Componentes del sistema de PCR: solución buffer y MgCl Se utiliza un buffer Tris-HCl, de ph 8,4 (tºamb). La concentración de MgClinfluye directamente en la actividad de la polimerasa, y es uno de los parámetros a ajustar: Si la concentración de Mg 2+ es deficiente, la eficiencia de la enzima. Si la concentración de Mg 2+ es excesiva, la polimerización inespecífica. La concentración ideal de MgCl varía dependiendo de: Conc de ADN molde de partida. Conc. y longitud de cebadores. Long. del amplicón. Conc. de dntps.

15 Componentes del sistema de PCR: dntps Generalmente se utilizan concentraciones equimolares de los 4 dntps(datp, dctp, dgtp, dttp). Concentraciones mayores a 4mM inhiben la PCR por quelación de Mg 2+.

16 Protocolo típico de una reacción de PCR. 1º) Desnaturalización inicial(94 95ºC; 5 min) 2º) Desnaturalización (94 95ºC; 30 seg 1 min) 3º) Hibridación (tº específica para c/par de cebadores; 30 seg) 4º) Elongación (72ºC; 30 seg 3 min, dependiendo del tamaño del amplicón) 5º) Elongación final(72ºc, 5 min) Los pasos 2, 3 y 4 constituyen un ciclo de PCR y se repiten entre veces.

17 Etapas de un ciclo de PCR. 94ºC 72ºC Tm Primers (min)

18 Etapas de una PCR: Mezcla inicial

19 Etapas de un ciclo de PCR: Desnaturalización

20 Etapas de un ciclo de PCR: Hibridación

21 Etapas de un ciclo de PCR: Elongación

22 Reacción de PCR: esquema de amplificación exponencial

23 [ADN] Fase lag Nº de ciclo Fase exponencial Pérdida de eficiencia de PCR Fase de meseta Factores que llevan a la pérdida de eficiencia de PCR luego de varios ciclos: Disminución de actividad de la polimerasa. Disminución de la disponibilidad de dntpsy cebadores. Disminución de la disponibilidad de Mg 2+, para el funcionamiento de la enzima.

24 CONDICIONES PARA MEJORAR LA ESPECIFICIDAD DISMINUIR Mg 2+ [dntps] AUMENTAR T annealing Tiempo de los ciclos Número de ciclos [primer]

25 TIPOS DE PCR SEGÚN LA MUTACION A DETECTAR GRANDES DELECIONES MUTACIONES PUNTUALES Y DELECIONES PEQUEÑAS PCR Multiplex GAP-PCR MLPA MUTACION O POLIMORFISMO DESCONOCIDO (Métodos de barrido) PCR-RFLP Mutagenesis mediada por PCR Alelo-Específicas: PCR-MAS PCR-ARMS/MARMS PCR-ASO Plataformas: PCR-OLA PCR-SSCP PCR-DGGE

26 PCR-MAS Es la amplificación, en un único tubo, de múltiples fragmentos de una determinada secuencia. Elección correcta de pares de primers que deberán dar lugar a fragmentos de diferente tamaño, que deberán ser fácilmente resueltos enunaúnicalíneadecorridade ungel. Los primers usados son alelo-específicos. Mutaciones puntuales. Ej fibrosis cística. P1 P2 P3 P4 N M N M N M N M - - WT (139 pb), ΔF508 (136 pb), G542X (174 pb) y N1303K (240 pb)

27 PCR-MULTIPLEX Grandes deleciones. Ej: Distrofia muscular de Duchenne. Análisis del gen de la distrofina por PCR multiplex, detección de deleciones. Los números superiores corresponden a cada pacientes. Los números de la derecha corresponden a los exones amplificados. N: Control normal con todos los exones. Paciente 2 presenta deleciones en los exones 50 y 52. Paciente 1 presenta deleciones en los exones 50, 47 y 52. Paciente 10 presenta deleción en el promotor Pm. Paciente 7 presenta deleción en el exón 52. Paciente 4 presenta deleción en los exones 3 y 6. Paciente 5 presenta deleciónenlosexones43,13y47.

28 PCR-SSCP Single strand conformation polymorphism Se amplifica el fragmento de interés por PCR. El ADN amplificado es sometido a desnaturalización por calor o agentes químicos como la formamida y luego se enfría rápidamente en hielo(cambio brusco de temperatura) Estos fragmentos se someten a electroforesis en geles de poliacrilamida nativos(no desnaturalizantes). Durante la electroforesis, los fragmentos de ADN adoptan una forma tridimensional específica de acuerdo a su secuencia de nucleótidos, de esta manera cada fragmento presenta una conformación única. Debido a esto, la movilidad electroforética dependerá de la conformación tridimensional que adopte el fragmento. La sola presencia de una sola base de diferencia entre fragmentos de ADN es suficiente para que los mismos adopten diferentes conformaciones y migren en posiciones diferentes durante la electroforesis.

29 PCR-SSCP Single strand conformation polymorphism

30 PCR-SSCP Single strand conformation polymorphism

31 PCR-DGGE Denaturing Gradient Gel Electrophoresis Se amplifica el fragmento de interés por PCR. Los amplicones son separados en un gel de poliacrilamida desnaturalizante (gradiente de urea y formamida) Si se desnaturaliza con gradiente de temperatura, la técnica se denomina TGGE. Durante la corrida, los amplicones se desnaturalizan parcialmente (formando una estructura en forma de Y) a una concentración específica del agente desnaturalizante y detienen su migración en el gel. Los fragmentos con diferentes puntos de desnaturalización, lo que dependerá de su secuencia de ADN, migrarán a diferentes posiciones.

32 simple complejo 20% 80% Henrik Nissen et al. Circulation. 1995;91: Denaturing gradient gel electrophoresis analysis of DNA from 21 members of the Danish kindred with the French-Canadian Trp66-Gly mutation of the low-density lipoprotein receptor gene.

33 PCR-DGGE Denaturing Gradient Gel Electrophoresis

34 CONTROLES DE PCR Control negativo Tubo extra en el cual se colocan todos los reactivos utilizados en la mix de PCR, excepto ADN. Si en esta muestra hay amplificación significa que en algún reactivo hay restos deadnodeproductodepcrqueestácontaminandolareacción. Control interno Consiste en la amplificación de un gen no relacionado con la secuencia de interés, cuya expresión no varía y además debe expresarse en todas las células (ej: GAPDH, actina, 28S). El control interno siempre debe amplificarse, es decir, el amplicón siempre debe visualizarse luego de la electroforesis. Es un fragmento diferente de la secuencia blanco que se incluye en el mismo tubo de reacción y se amplifica simultáneamente con la secuencia diana Este amplicón no debe competir en la amplificación del producto de interés y debe ser posible discriminarlo del mismo(tamaño diferente). Se utiliza como un indicador de buena extracción de ADN, calidad de las muestras y calidad de la reacción de PCR, ya que da una idea de la presencia de inhibidores de la reacción y de la calidad del ADN y si la reacción de PCR fue correcta o fallida.

35 CONTROLES DE PCR Negative samples