UNIVERSIDAD NACIONAL DE MISIONES Facultad de Ciencias Exactas Químicas y Naturales TRABAJO PRÁCTICO Nº 4 REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR)

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Trinidad Duarte Ramos
hace 8 años
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TRABAJO PRÁCTICO Nº 4 REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR) INTRODUCCIÓN La reacción en cadena de la polimerasa o PCR (del inglés Polymerase Chain Reaction) es una técnica relativamente simple y

1 TRABAJO PRÁCTICO Nº 4 REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR) INTRODUCCIÓN La reacción en cadena de la polimerasa o PCR (del inglés Polymerase Chain Reaction) es una técnica relativamente simple y poderosa en Biología Molecular, que a diferencia del método clásico de clonación celular requiere de apenas algunas pocas horas para llevarse a cabo. Representa un método enzimático in vitro, acelular y sumamente eficiente, utilizado para la amplificación de secuencias específicas a partir de pequeñas concentraciones de ADN o ARN, obtenido de diferentes fuentes. Estas características sobresalientes transforman a la reacción de PCR en una técnica extremadamente útil no solo en investigación básica, sino que también en aplicaciones tales como la identificación genética, genética forense, controles de calidad industriales, diagnóstico in vitro (ver más adelante!). Premio Nobel en Química, conjuntamente con Michael Smith, Una reacción de PCR clásica requiere de los siguientes componentes: a) el ADN molde, b) un set de oligonucleótidos ( primers o cebadores) que flanquean la región de ADN de interés, c) una ADN polimerasa termoestable, d) los cuatro dntps (datp, cctp, dgtp, dttp) e) un buffer de reacción y f) un ion metal. La reacción ocurre en un ciclador térmico, un equipo que proporciona a la muestra una serie de diferentes temperaturas que permiten: 1) la desnaturalización del molde (a 94 ºC o más durante 15 o hasta 2 min), 2) la asociación estable (hibridación o annealing) de los oligonucleótidos (a 40-60ºC y durante ) al ADN desnaturalizado proporcionando el cebador para la ADN polimerasa y finalmente 3) la síntesis de nuevas cadenas de ADN, a cargo de la ADN pol (a 72 ºC, durante 1-2 min), constituyendo los tres pasos UN ciclo de reacción. En el siguiente ciclo el equipo vuelve al paso 1!! y repite los tres pasos unas veces permitiendo el copiado del ADN molde a través de varios órdenes de magnitud, generando millones de copias de una secuencia de ADN particular. El ciclo de desnaturalización, apareamiento y síntesis de ADN se itera y dado que el producto de una ronda de amplificación sirve como molde para la siguiente, cada ciclo sucesivo en teoría duplica la cantidad de ADN en la reacción. El principal producto de esta reacción exponencial es un segmento de ADN bicatenario (o amplicón) cuyos extremos están definidos por el extremo 5 de cada oligonucleótido o primer. Uno de los componentes claves en todo ciclador térmico es el software de control, el cual debe ser capaz de: Controlar de forma precisa las temperaturas de incubación. Almacenar en una memoria no volátil los parámetros de ciclado. Ejecutar diferentes rutinas y secuencias de ciclado. Mostrar en tiempo real los parámetros de funcionamiento del ciclador. Normalmente la programación de un ciclador térmico incluye tres pasos fundamentales. A continuación complete los rangos de tiempo y temperatura correspondientes en cada caso: Cátedra Genética Molecular Trabajos Prácticos

2 ETAPAS Desnaturalización Hibridación Extensión PASO t Tº T Tº t Tº Hold Inicial Ciclo iterativo a 72º Hold Final b 72º a: 1 por cada kb b: depende de la longitud del fragmento buscado entre 3 y 15 min. TP 5: PARTE I Objetivo: con el presente trabajo práctico se pretende que los alumnos entiendan los fundamentos de la amplificación acelular, a través del manejo manual de la misma y la utilización de herramientas bioinformáticas aprendidas en prácticos anteriores. Asimismo, se espera que los alumnos sean capaces de identificar los inconvenientes de la técnica y encontrar posibles soluciones a la misma. Dada la secuencia del gen zfy-2 de Mus (Mardon and Pagge, 1989, Cell. Vol 56, ) 1. Determinar la localización de los primers AK-1 y AK Calcular el tamaño del fragmento que será amplificado y seleccionar un marcador de peso molecular adecuado para su puesta en evidencia mediante electroforesis. 3. Calcular la Tm para cada primer (F y R). 4. Interpretar los resultados obtenidos de la amplificación analizando las fotografías de geles A, B y C de la página siguiente. En las tres fotos se utilizaron los primers AK1 y AK2 para amplificar el fragmento del gen zfx y zfy de hembras y machos de diferentes especies de roedores. La Tm utilizada fue de 53ºC. Completar la siguiente actividad: a) Determine y describa qué marcador de PM se utilizan en las tres corridas electroforéticas? b) Indique a qué podrían corresponder las bandas más bajas en las 3 fotografías? c) Trate de determinar si a su juicio existirían indicios de contaminación en las amplificaciones. d) Determine si el producto amplificado posee el PM estimado en el punto 2. e) En la foto A, a qué podría atribuirse el tamaño de la última banda? f) En la foto B, se utilizó el mismo marcador de PM que en A y C? Se obtuvo amplificación en todos los caminos? Todas las bandas poseen la misma intensidad? Por qué? g) En aquellos casos donde hubo escasa amplificación, considera Ud. que podrían someterse esas muestras a una nueva amplificación? Justifique su respuesta. h) Cuál es la limitante, en cuanto al tamaño del ADN molde, que puede ser amplificado por esta metodología? AK-1F 5 GTCTATCCTTGCATGTTTTGTG 3 AK-2R 5 ATGTCGCATTATGTGTTGATTC 3 Detalle de las Figuras (A, B y C) para analizar correspondientes a la amplificación del fragmento deseado a partir de los cebadores AK1 y AK2. Cátedra Genética Molecular Trabajos Prácticos

3 A B C Cátedra Genética Molecular Trabajos Prácticos

4 TP-5: PARTE II En esta segunda parte se trabajará con el cálculo de los reactivos para preparar la mezcla de reacción o Master Mix. Se pretende amplificar parte del gen cloroplástico trnl-uaa, a partir de ADN genómico total obtenido de tejido foliar. A continuación se deberán calcular las cantidades de cada componente que será incluido en la mezcla de reacción para efectuar la amplificación. 1. Previamente, se deben eluir los primers liofilizados para preparar la solución stock que será empleada para la PCR. A modo de práctica, consulten la hoja de información que acompaña los primers y resuelvan: a) Qué volumen se debe añadir al liofilizado para obtener una concentración de 100 µm? b) Qué buffer se recomienda para realizar la elusión de los primers? c) Calcular el volumen de la solución 100 µm que será necesario para preparar una dilución de volumen igual a 100 µl y concentración 10 µm. 2. Con ayuda de la hoja de información del Set de dntps, indicar los volúmenes de cada dntp y de agua necesarios para obtener una solución stock de 2 mm, y volumen final de 1 ml. 3. Registrar las concentraciones finales y calcular los volúmenes finales por tubo y para la mezcla de reacción de cada componente considerando que el número total de muestras a amplificar serán CINCO. Volumen final de reacción (VF)= 50μl. Incorporar aceite mineral si es necesario. Componentes Concentración Concentración Cantidad de µl Cantidad de µl inicial (stock) final por tubo para Master Mix Buffer 10 X MgCl2 25 mm dntps 2 mm Primer F 10 µm Primer R 10 µm Taq polimerasa 5U/µl ADN (stock) --- H2O destilada c.s.p. PERFIL DE CICLADO Etapa t Tº Hold inicial Desnaturalización Annealing Extensión Extensión final 30 h 4 ºC ciclos iterativos Cátedra Genética Molecular Trabajos Prácticos

5 4. Luego de preparar la Master Mix, se les propone investigar sobre el fragmento que será amplificado. Se les brinda las secuencias de los cebadores foward(f) y reverse(r). Para este ejercicio necesitarán instalar el software ClustalX disponible en el aula virtual. El programa Primer3 y Primer-BLAST se encuentran on line. a) Efectuar la búsqueda del gen en GenBank y determinar cuál es su acrónimo y la información relacionada con el locus, estructura del gen, producto que codifica, etc. b) Detallar el número de acceso de la secuencia, descargarla en formato FASTA o.txt. Qué es el número de acceso? En qué consiste el formato FASTA? c) Probar especificidad de los cebadores mediante Primer-BLAST. d) Utilizando el programa Primer3 localizar la posición de los primers en la secuencia del gen. e) Estimar el tamaño del fragmento que será amplificado (amplicón). Cbra_F 5 AAA ATG GGC AAT CCT GAG C 3 Cbra_R 5 ATG GGA CTC TAT CTT TAT TCT CG 3 f) Utilicen ClustalX para alinear la secuencia target y ambos primers. Una vez realizado el alineamiento observen y verifiquen si existe o no alineamiento. 6. Verificación de los productos amplificados. Para visualizar los amplicones será necesario preparar un gel de agarosa al 2% calcular cuánta agarosa será necesario pesar! 7. Ejercicio complementario Se pretende amplificar el gen de Amelogenina, a partir del ADN genómico total obtenido de tejido cadavérico. A continuación se les propone investigar sobre el gen de mención. Se les brinda las secuencias de los cebadores foward(f) y reverse(r) que delimitan una región del mencionado gen. a) Efectuar la búsqueda del gen en GenBank y determinar cuál es su acrónimo y la información relacionada con el locus, estructura del gen, qué codifica. b) Detallar el número de acceso y obtener la secuencia. c) Probar especificidad de los cebadores mediante Primer-BLAST. d) Utilizando el programa Primer3 localizar la posición de los primers en la secuencia del gen. Si aparecen inconvenientes ensayen lo siguiente. 1-Prueben ubicar con Primer3 un cebador por vez 2- Describan qué resultados obtienen en cada caso. e) Estimar el tamaño del fragmento que será amplificado (amplicón). f) F 5 AATTCTCTCACAGTCCAAG 3 R 5 ACAGGTAATTTTCCTTTAG 3 Cátedra Genética Molecular Trabajos Prácticos

6 f) Utilicen ClustalX para alinear la secuencia target y ambos primers. Una vez realizado el alineamiento que ocurre con el mismo. Analicen y discutan los resultados obtenidos con Primer3. g) Vuelvan al Primer3 e intenten localizar los sitios de annealing de los primers modificando los parámetros de búsqueda del programa. Detallar de qué forma/s lo resuelven. Cátedra Genética Molecular Trabajos Prácticos

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