Proyecto de Fin de Cursos

Transcripción

1 Universidad de la República Oriental del Uruguay Proyecto de Fin de Cursos ELECTROFORESIS EN GEL DE MOLÉCULAS DE ADN Noviembre de 2006 Carolina Etchart C.I Marcelo Lavagna C.I

2 ELECTROFORESIS EN GEL DE MOLÉCULAS DE ADN Introducción La electroforesis en gel es un grupo de técnicas empleadas por los científicos para separar moléculas basándose en propiedades como tamaño, forma o punto isoeléctrico. La electroforesis en gel se utiliza generalmente con propósitos analíticos, pero puede ser una técnica preparativa para purificar moléculas parcialmente antes de aplicar una espectroscopia de masas, una PCR, una clonación o una secuenciación de ADN. La segunda parte del nombre, gel, se refiere a la matriz usada para separar las moléculas. En muchos casos un gel es un polímero entrelazado de porosidad controlable. Cuando la separación es de proteínas, ADN o ácidos nucleicos pequeños, el gel está compuesto por diferentes concentraciones de acrilamida y un iniciador de la polimerización, para producir redes de poliacrilamida de diferentes tamaños. Para separar ácidos nucleicos grandes (más de unos centenares de bases), la matriz empleada es de agarosa purificada, un polisacárido extraído de algas marinas. En ambos casos, el gel forma una matriz sólida pero porosa La primera parte del nombre, electroforesis, se refiere a la fuerza electromotriz que es empleada para desplazar las moléculas a través del gel. Al situar las moléculas en el gel y aplicar una diferencia de potencial eléctrico, las moléculas se mueven a diferentes velocidades, hacia el cátodo si están cargadas positivamente y hacia el ánodo si están cargadas negativamente. En los ácidos nucleicos la dirección de migración es del electrodo negativo al positivo, y esto es debido a que poseen una carga negativa. En los fragmentos de ADN dobles (con estructura de doble hélice) la velocidad de migración es proporcional a su tamaño. En fragmentos simples de ADN (una sola cadena) y ARN, dichas moléculas tienden a plegarse de forma compleja y a migrar de forma complicada, según la estructura terciaria formada tras el plegamiento. Sin embargo, compuestos que puedan romper los enlaces de puente de hidrógeno, como el hidróxido de sodio o la formamida, son empleados para 'desplegar' las moléculas plegadas y permitir que la velocidad de migración dependa únicamente del tamaño y no de la estructura formada tras el plegamiento. Cuando se ha completado la electroforesis, las moléculas más pequeñas han llegado al ánodo. Entonces se pueden 'revelar' mediante la adición de un colorante específico para hacerlas visibles. Se emplean compuestos como el bromuro de etidio o la plata. Asimismo se emplean otros métodos para visualizar la separación de la mezcla en el gel. Si el reactivo es fluorescente bajo luz UV, se puede simplemente hacer una fotografía de la placa bajo dicha luz. También, si las moléculas contienen átomos radiactivos se puede efectuar un autoradiograma. Si se han inyectado varias mezclas una junto a otra en la placa, se producirán separaciones paralelas. Cada separación mostrará distintas bandas correspondientes a cada componente de la mezcla. Si las separaciones son incompletas, se dará un solapamiento entre bandas haciendo indistinguibles dos o más componentes.

3 Las bandas en diferentes separaciones paralelas están a la misma distancia del principio significa que contienen moléculas que han atravesado el gel a la misma velocidad. Existen marcadores especiales que contienen una mezcla de moléculas de tamaño conocido. Si se hace una electroforesis de un marcador con una mezcla desconocida, llamada patrón, las bandas observadas en el marcador pueden ser comparadas a las obtenidas en la mezcla desconocida para determinar su tamaño. La distancia a la que se encuentra la banda del principio es (aproximadamente) inversamente proporcional al logaritmo del tamaño de la molécula. Descripción del proyecto En nuestro caso trabajaremos con imágenes de electroforesis realizadas a cadenas de ADN en las que el gel utilizado es la agarosa. Por tanto, el objetivo del proyecto es la detección de los largos de las cadenas de ADN pertenecientes a las moléculas que fueron colocadas en cada pista y compararlas con la muestra patrón. A su vez, se deberá detectar en qué pista se encuentra el patrón, lo cual puede ser utilizado como dato, y según el valor de la concentración del gel, calcular la escala de valores del mismo. Con dichos datos podremos estimar qué valores toman los largos detectados, siendo esta la salida del programa. Para comprobar el funcionamiento de nuestro programa, contaremos con los resultados obtenidos por los investigadores del tema. Imágenes de muestra

4 Procedimiento de análisis y técnicas a utilizar Datos de entrada al programa: - N: Cantidad de hendiduras - n: Ubicación de pistas activas - p: Posición de la muestra patrón - : Porcentaje de concentración del gel de agarosa - Im: La imagen a analizar hacia Condiciones de la imagen de entrada: - Hendiduras hacia arriba - Hendiduras de igual tamaño Procedimiento de análisis: - Pasaje a escala de grises de la imagen original y rotación en caso necesario. - Estimación de la distancia entre hendiduras (teniendo en cuenta el ancho de la imagen y la cantidad de hendiduras (N)) - Detección de hendiduras. - Binarización de la imagen - Recorte de la imagen en la zona de ubicación de las hendiduras (aprox.) - Cálculo de la apertura de la imagen binarizada y recortada. - Detección de zonas blancas y almacenamiento en un registro adicional de la posición (dos valores: el píxel más a la izquierda y el más a la derecha) de dichas zonas en la imagen (teniendo en cuenta la distancia entre hendiduras). - Almacenamiento en un registro adicional de la posición del centro (promedio de los valores hallados en el paso anterior) de las zonas blancas detectadas. - Detección del patrón y asignación de valores al mismo. - Ubicar la hendidura número p (dato de entrada). - Recorte de la imagen en la zona del patrón (teniendo en cuenta la posición de los centros de las hendiduras adyacentes). - Ecualización adecuada de la nueva imagen. - Umbralización del gradiente de la ecualización anterior (filtro Sobel). - Moviéndonos verticalmente en la posición del centro de la hendidura correspondiente, detectaremos pixeles negros (inicio de una franja del patrón) y el segundo pasaje por un cambio a blanco (fin de la misma franja del patrón). El valor promedio se almacenará en un registro, al mismo tiempo que el valor correspondiente en pb (pares de bases). - Detección de muestras y asignación de valores a las mismas. - Ubicar la hendidura número n(i) (dato de entrada). - Recorte de la imagen en la zona de la muestra i (teniendo en cuenta la posición de los centros de las hendiduras adyacentes). - Ecualización adecuada de la nueva imagen. - Umbralización del gradiente de la ecualización anterior (filtro Sobel).

5 - Moviéndonos verticalmente en la posición del centro de la hendidura correspondiente, detectaremos pixeles negros (inicio de una franja de la muestra i) y el segundo pasaje por un cambio a blanco (fin de la misma franja de dicha muestra). El valor promedio de cada franja detectada se almacenará en un registro, y se interpolará con los datos obtenidos de las franjas del patrón, almacenándose el valor correspondiente en pb (pares de bases). - Visualización de resultados. Plan de trabajo Día Tarea 0 Semana del Planteo y organización de las tareas 13 al 17 Realización del presente informe 1 Martes 21 Recorte de imágenes 2 Viernes 24 Detección de hendiduras 3 Martes 28 Detección de franjas 4 Viernes 01 Detección de franjas 5 Martes 05 Interpolación de datos Página Web 6 Viernes 08 Página Web Preparación de la presentación 7 Martes 12 Presentación oral Nota: En caso de ser necesario se incluirán más reuniones. Bibliografía - Gel Electrophoresis of DNA Libro concedido por investigadores del Clemente Estable. - Wikipedia : " - Internet Agradecimientos Instituto de Investigaciones Biológicas Clemente Estable Extracción de las imágenes utilizadas e información sobre el tema. En especial, a Patricia Vaz y a Uriel Koziol.