PROPIEDADES FISICOQUÍMICAS DE LOS ÁCIDOS NUCLEICOS. Es un ácido capaz de formar sales con iones cargados

Transcripción

1 Extracción de ADN

2 Genética molecular PROPIEDADES FISICOQUÍMICAS DE LOS ÁCIDOS NUCLEICOS Es un ácido capaz de formar sales con iones cargados positivamente (cationes). Es soluble en soluciones concentradas de sales. Es insoluble en alcoholes (tipo etanol o isopropanol). El ADN es destruido (depurinado) a ph ácido (menor de 4,0), es insoluble a ph 5.6, pero es soluble a ph 8,0.

3 Genética molecular PROPIEDADES FISICOQUÍMICAS DE LOS ÁCIDOS NUCLEICOS Concentración Salina La mayor concentración de iones positivos en el medio (Na+, K+) neutraliza la carga negativa de los fosfatos del esqueleto fosfodiester, disminuyendo las fuerzas de repulsion y estabilizando la estructura de la doble helice.

4 Genética molecular PROPIEDADES FISICOQUÍMICAS DE LOS ÁCIDOS NUCLEICOS Hidrolisis Quimica La hidrólisis ácida remueve todas las bases púricas (hidrólisis de uniones N-glicosídicas entre pentosa y las bases púricas) sin afectar las uniones fosfodiéster del esqueleto nucleotídico. A ph alcalino, el ADN es resistente, mientras que el ARN se hidroliza completamente (presencia de OH en el C2 de la pentosa).

5 Extracción y Purificación de ADN

6 Extracción y Purificación de ADN La extracción y purificación de ácidos nucleicos constituye la primera etapa de la mayoría de los estudios de biología molecular y ADN recombinante. Existen diversos métodos de extracción de ADN, en función del tipo de muestra y del grado de pureza que se pretende obtener Tener claros los objetivos analíticos para seleccionar correctamente el método más adecuado de extracción. La calidad y la pureza de los ácidos nucleicos son dos de los elementos más importantes en este tipo de análisis.

7 Aislamiento de Ácidos Nucleicos La elección de la técnica más adecuada suele efectuarse conforme a los criterios siguientes: Ácido nucleico diana (ADN o ARN) Estructura del acido nucleico (genómico, plasmídico, mitocondrial, etc) Organismo fuente Material inicial (tejido, células en suspensión, hoja, semilla, material transformado, etc.) Resultados deseados (rendimiento, pureza, calidad, tiempo que requiere la purificación) Uso posterior (PCR, clonación, RFLP, transferencia, RT-PCR, síntesis de ADNc, etc.)

8 Pasos generales en la Extracción de Ácidos Nucleicos 1- Homogeneización o lisis: Permite la disgregación de la estructura tisular y celular facilitando la salida de los ácidos nucleicos. 2- Separación y purificación: Permite la eliminación progresiva de proteínas y otros contaminantes celulares, y la obtención de un material genético cada vez más limpio. 3- Precipitación: Permite la obtención de un ácido nucleico purificado, listo para ser almacenado o diluido en concentración deseada para su análisis

9 1- Lisis de Células o Tejidos Tiene que ser suficientemente fuerte para romper el material inicial complejo (Ej: un tejido), pero suficientemente suave para preservar el ácido nucleico diana. rotura mecánica (trituración, lisis hipotónica, etc.) tratamiento químico (detergentes, agentes caotrópicos, reducción con tioles, etc.) digestión enzimática (Proteinasa K, etc.) Una misma solución puede contener detergentes que solubilicen las membranas celulares y sales caotrópicas fuertes que inactiven las enzimas intracelulares.

10 2- Eliminación de proteínas y restos celulares Tras la lisis celular y la inactivación de las nucleasas, los restos de células se eliminan fácilmente por precipitación. DNA debe ser disociado de : Proteinas Ciertas enzimas (ej nucleasas) deben ser inactivadas por desnaturalización : Detergentes ej: Dodecil sulfato sódico (SDS) Enzimas ej: Proteinasa K Solventes ej: Cloroformo, Fenol Sales ej: acetato de amonio, NaCl

11 3- Precipitación del ADN La precipitación de los ácidos nucleicos permite su purificación y concentración ALCOHOL ADN Se basa en la deshidratación de la molécula mediada por el agregado de alcoholes, típicamente etanol o isopropanol, lo cual lleva a su precipitación. La precipitación es un fenómeno reversible, mediante la disolución del Acido Nucleico en soluciones acuosas

12 Electroforesis

13 Electroforesis La electroforesis en gel es un método utilizado para separar macromoléculas en función del tamaño, la carga eléctrica y otras propiedades físicas. El término electroforesis describe la migración de las partículas cargadas bajo la influencia de un campo eléctrico, que genera la fuerza desplazamiento de las moléculas a través de la matriz del gel. La corriente pasa a través del gel con la ayuda de un medio líquido (buffer).

14 Geles de Agarosa Electroforesis El gel actúa como tamiz molecular, separando las moléculas en función de su tamaño.

15 Electroforesis Una vez separados en el gel, los fragmentos de ADN de las muestras COLORANTE INTERCALANTE DE BASES se detectan mediante tinción con agentes intercalantes como el bromuro de etidio.

16 Electroforesis Los fragmentos, una vez teñidos, pueden ser visualizados utilizando un Transiluminador de Luz Ultravioleta

17 FIN