Laboratorio de Marcadores Moleculares del Programa de Cereales y Granos Nativos

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1 Laboratorio de Marcadores Moleculares del Programa de Cereales y Granos Nativos GUÍA PRÁCTICA: INTRODUCCIÓN AL USO DE MARCADORES MOLECULARES EN EL ANÁLISIS DE DIVERSIDAD GENÉTICA Bloque Práctico (Chirinos Arias, Michelle Christine y Sota Cano, Angela Fiorella). I. Seguridad en el Laboratorio de Marcadores Moleculares. Compuestos cancerígenos o Bromuro de etidio o Acrilamida. II. Introducción al proceso del laboratorio. El conocimiento de las relaciones y variaciones genéticas existentes entre individuos son pre requisitos para procesos de mejoramiento genético (Ginwal et al., 2010), ya que esta información permite el screening de accesiones, la eficaz selección de parentales y progenies (Khanuja et al., 1999). Existe un gran número de técnicas que permiten el análisis de las relaciones y variaciones genéticas existentes dentro y entre especies. Las técnicas más confiables y de menor tiempo de análisis son las técnicas genéticas. Estas analizan directamente las variaciones genotípicas (Ginwal et al., 2010) y su eficacia depende directamente de la calidad e integridad del ADN aislado (Colosi et al., 1993). III. Extracción de ácidos nucleicos de plantas Introducción. Existen muchos protocolos de extracción de ADN, cada uno de ellos están modificados para la extracción eficaz de ADN de una especie en particular. Esto debido a que el uso

2 de un mismo protocolo en diferentes especies no garantiza un buen rendimiento de ADN puro e íntegro (Joshi et al., 2010). Fundamentos. Una de las primeras consideraciones para la extracción de ADN de plantas es la manera como se colecta y almacena el tejido vegetal (Ferreira & Grattapaglia, 1998). Según Joshi et al. (2010), el tejido vegetal a usar para la extracción debe de ser joven debido a que estos acumulan menos polisacáridos que los tejidos adultos y por tanto disminuyen el riesgo de contaminación por carbohidratos. Por otro lado, el material fresco puede ser colectado y mantenido en hielo o en un frigorífico por unos días. Si el almacenamiento se prolonga, la muestra puede ser congelada a -20 C durante algunas semanas (Ferreira & Grattapaglia, 1998). El método más utilizados para la extracción de ADN es el CTAB. Denominados así por la presencia del detergente catiónico CTAB (cationic hexadecyl trimethyl ammonium bromide) A continuación se hará mención de los componentes presentes en el buffer de extracción: ph de solución, sistema Tris-HCl: Se debe mantener un ph entre 8.0 a 8.3, ya que las nucleasas tienen un ph óptimo de 7 donde su actividad es mejor. Mientras que, otras enzimas oxidasas u oxigenasas tienen un ph óptimo de 5 a 6. Por lo que un sistema alcalino funciona mejor para evitar la degradación del ADN. Detergente catiónico CTAB: Se encarga de solubilizar las membranas celular y nuclear. NaCl

3 EDTA (ácido etilendiamino tetra acético): Es un agente quelante que atrapa iones Mg+2, cofactores de nucleasas. 2-mercaptoetanol: Agente antioxidante, al igual que el PVP. Componentes presentes durante la extracción de ADN: Cloroformo: alcohol isoamílico: Etanol 96 y 70 : Protocolo de extracción de ácidos nucleicos MicroCTAB 1. Cortar las dos primeras verdaderas hojas. 2. Secar aproximadamente mg de hoja en sílica gel. 3. Colocar las hojas secas en tubos 1. 5 ml (previamente etiquetados) con seis perlas de metal. 4. Moler las muestras.

4 5. A la muestra molida agregar buffer de extracción que contiene CTAB (por cada mililitro de buffer echar tres microlitros de mercaptoetanol). 6. Lavar la muestra hasta dejar las paredes del tubo limpias (no debe quedar restos de muestra). 7. Llevar al Termomixer (baño María). 8. Agregar a este tubo con muestra cloroformo: alcohol isoamílico (24:1). 9. Lavar suavemente por inmersión. 10. Cuando se obtenga una mezcla homogénea llevar a la centrífuga 3000 R.P.M. por 10 minutos.

5 11. Se formarán tres fases (acuosa, interface, orgánica) 12. Retirar la fase acuosa con cuidado de no tocar las demás fases. 13. Colocar la fase acuosa en otro tubo con cloroformo: alcohol isoamílico (24:1). 14. Lavar suavemente por inmersión. 15. Centrifugar nuevamente 3000 R P.M. por 10 minutos. 16. Retirar el sobrenadante y agregarlo en otro tubo con etanol de 96% (el cual debe estar frío). 17. Mover por inmersión suavemente y observar la formación de medusa. 18. Desechar el sobrenadante.

6 19. Lavar con etanol al 70% 20. Esperar 5 minutos y centrifugar 13000rpm 21. Desechar el sobrenadante. 22. Agregar etanol al 70% 23. Centrifugar 24. Desechar el sobrenadante. 25. Dejar secar. IV. Cuantificación de ADN Varias son las técnicas utilizadas en la cuantificación de ADN, aunque la más utilizada es mediante el uso del espectrofotómetro. Este método consiste en la medición de la absorbancia de luz ultravioleta de las soluciones donde se encuentran el ADN extraído y purificado.

7 Según Gerstein (2001), la concentración de ADN se determina midiendo su absorbancia a 260nm/280nm y comparándola con un blanco (el cual puede ser agua miliq). Los cocientes puros de ADN son aproximadamente de 1.8 y 2.0. Un estimador de la pureza del ADN extraído es según Sambrook et al. (1989). Valores mayores a 2.0 indican la presencia de ARN y valores menores a 1.8 contaminación con proteínas. A 260 nm se puede medir a contaminantes como las sales, los solventes orgánicos y proteínas. Una absorbancia a 230nm significa que la muestra está contaminada con carbohidratos, péptidos y fenoles. Protocolo de cuantificación de ADN en el espectrofotómetro 1. Limpiar el área de trabajo con etanol 70% y trabajar con guantes en todo momento. 2. Agregar en los tubos con pellet secos 50µL de buffer TE y llevar al termomixer en caso sea necesario (resuspensión). 3. Sacar tubos del termomixer y agregar 2µL de RNAsa (10mg/mL). Llevar al termomixer 37ºC por 45 minutos. 4. Sacar los tubos del termomixer, en una placa de tubos mezclar 198µL de agua miliq autoclavada y 2µL de muestra, dejar un tubo de la placa con 200µL de agua miliq autoclavada para utilizarlo como blanco. 5. Presionar Dilution 6. 2 y Enter y Enter. 8. Poner pipetor en 200µL 9. Absorber el blanco y ponerlo en la cubeta. 10. Limpiar la cubeta con papel Tissue y colocarla en el espectrofotómetro. 11. Presionar Biofotómetro Blank 12. Absorber las muestras.

8 13. Colocar la cubeta con la muestra en el espectrofotómetro. 14. Biofotómetro Sample Cada vez que se haga un cambio de muestra se debe enjuagar la cubeta con agua mili Q y dejarla secar boca abajo sobre el papel secante para asegurar una buena lectura. Si las paredes de la cubeta de cuarzo se han mojado se deben secar con mucho cuidado con el papel tissue, evitando en todo momento coger la superficie de la cubeta que se leerá en el espectrofotómetro (es decir la traslúcida). El espectrofotómetro nos dará una lectura de la concentración de ADN en ng/µl, la pureza del ADN que se mide usando la proporción 260/280 la cual debe oscilar entre 1.80 y 2.0 además que la concentración de polisacáridos (260/230) la cual debe ser baja. Las burbujas influyen en la medición de la absorbancia por ello debemos asegurarnos que no estén presentes. V. Calidad de ADN en gel de agarosa. Para visualizar la calidad de ADN se utiliza una electroforesis en soporte de agarosa, para la preparación de este gel usamos agarosa al 1% o 0.8%, esto debido a que a mayor concentración de agarosa el entramado del gel es más restrictivo; con una concentración baja de agarosa logramos que los poros del gel sean más grandes y por lo tanto durante la electroforesis podemos ver si nuestro ADN está o no fragmentado y además ver la presencia de otras moléculas (usualmente polisacáridos). El ADN de calidad será un ADN no fragmentado que por su tamaño migrará lentamente y se quedará atrapado en la parte superior del gel, si el ADN está fragmentado se podrán ver otras bandas en el gel, el ARN no es visualizado pues antes de proceder a la corrida de la muestra se utilizan ARNasas. Si parte de la muestra se queda atrapada en los pozos probablemente está contaminada con algunos almidones que por su gran tamaño molecular no permitirán que la muestra migre por el gel.

9 Para este paso se utiliza bromuro de etidio, compuesto fluorescente altamente mutagénico que debe ser manipulado con mucho cuidado, siempre siguiendo las normas del laboratorio. Preparación del gel de agarosa. Se necesita: 1g de Agarosa 100mL de buffer TBE 1X (Tris+ EDTA+ ácido bórico a un ph 8.3) 3µL de Bromuro de etidio Agua destilada Pesar 1g de Agarosa en la balanza analítica, luego agregarlo a 100mL de buffer TBE al 1x. Llevar la mezcla al microondas para su disolución hasta que la solución empiece a burbujear. Sacar la solución del horno microondas, esperar que enfríe llevándola a un agitador magnético, agregar el bromuro de etidio con la micropipeta (se recomienda trabajar con la cámara de flujo laminar para prevenir la liberación de gases tóxicos al medio). Con el mismo tip disolver el reactivo en la solución, para ello se absorbe y expulsa la solución varias veces. Después de agregar el bromuro de etidio, vaciar la solución en el molde del gel previamente limpiado, sellado y con la cantidad de peines necesarios según el número de muestras por correr (cada peine forma un total de 15 pozos, si en caso se utiliza más de un peine estos serán colocados en forma paralela unos de otros y perpendicular con respecto al molde para tener facilidad al momento de analizar los resultados de la corrida).

10 Esperar aproximadamente 20 minutos para la gelificación del soporte de corrida, luego retirar los peines con mucho cuidado para mantener intactos los pocillos; llevar el soporte a la cámara electroforética, colocando los pozos cerca al polo negativo (de color negro) ya que las muestras de ADN migrarán hacia el polo positivo (color rojo) debido a que están cargadas negativamente por los fosfatos en su estructura. Protocolo de corrida Electroforética. Preparar las muestras de ADN a evaluar, para ello mezclar en una placa de tubitos 2µL de ADN y 8µL de colorante azul 6x. Agregar el ADN y mezclar con el colorante. Llenar los pozos utilizando la micropipeta graduada a 7µL, tapar la cámara electroforética, colocar el voltaje deseado y el tiempo de la corrida. A 20 minutos a 90 voltios. Posteriormente observarlo en el transiluminador y tomar una foto. VI. Referencias bibliográficas: 1. COLOSI J. and SCHAAL B Tissue griding with ball bearings and vortex mixer for DNA extraction. Nucleic Acids Research 21: DOYLE, J.J. & DOYLE, J.L A rapid DNA isolation procedure from small quantities of fresh leaf tissues. Phytochem Bull. 19:11-15.

11 3. FERREIRA, ME; GRATTAPAGLIA, D Introducción al uso de marcadores moleculares en el análisis genético. Brasilia, BR, EMBRAPA. 220 p. 4. GERSTEIN, A Molecular Biology Problem Solver: A Laboratory Guide. ISBNs: GINWAL H S. and SINGH S Evaluation and optimization of DNA extraction method for Dalbergia sissoo leaf. Indian Journal of Biotechnology 9: JOSHI N., RAWAT A., SUBRAMANIAN R. and RAO K A method for small scale genomic DNA isolation from chickpea (Cicer arietinum L.) suitable for molecular marker analysis. Indian Journal of Science and Technology 3: KHANUJA S., SHASANY A., DAROKAR M. and KUMAR S Rapid isolation of DNA from dry and fresh samples of plants producing large amounts of secondary metabolites and essential oils. Plant Molecular Biology Reporter 17: SAMBROOK J., FRITSCH E. F., MANIATIS T Molecular cloning: A laboratory manual. Cold Spring Habor Laboratory Press. 2nd Edition. New York. 3: 1659.

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