Actividad de Biología: Cromatografía de Pigmentos Vegetales Guía del Estudiante

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1 Actividad de Biología: Cromatografía de Pigmentos Vegetales Guía del Estudiante Objetivos: Los estudiantes serán capaces de Explicar cuáles moléculas hacen que muchas de las plantas tengan hojas verdes Explicar cómo los colores oscuros de las hojas están compuestos de pigmentos de diferentes colores Separar por medio de la técnica de cromatografía una mezcla de pigmentos Explicar la técnica de cromatografía y cómo se identifica los componentes de una mezcla. Estándares de contenido de Puerto Rico: La naturaleza de la ciencia Las explicaciones científicas deben cumplir con los siguientes criterios: ser consistentes con la prueba experimental y tener una estructura lógica. La estructura y los niveles de organización de la material Las propiedades características de las sustancias pueden ser utilizadas para separarlas e identificarlas cuando están presentes en una mezcla. Las propiedades macroscópicas de las sustancias dependen de las combinaciones y de las estructuras específicas de los átomos que las componen. Las interacciones Las sustancias, al juntarse, pueden formar mezclas o reaccionar químicamente. La conservación y el cambio Cuando se perturba un sistema, algunas propiedades cambian y otras se conservan. Ciencia, Tecnología y Sociedad El desarrollo y el uso del conocimiento científico y tecnológico conllevan decisiones éticas y morales. La tecnología ayuda a solucionar los problemas y a satisfacer las necesidades humanas. Trasfondo: La fotosíntesis es el proceso por el cual las plantas utilizan la luz para convertir bióxido de carbono y agua en carbohidratos. Luz + CO 2(g) + H 2 O (l) C 6 H 12 O 6(ac) + O 2(g) (Nota: la ecuación no está balanceada) 25

2 Las plantas contienen unos compuestos especializados conocidos como pigmentos que absorben la energía de la luz a longitudes de onda específicas y usan la energía para oxidar agua. Cuando el agua se oxida se produce oxígeno e iones de hidrógeno a la vez que se liberan electrones que dan comienzo a una secuencia de reacciones que culminan en la formación de glucosa. 2 H 2 O (l) O 2(g) + 4 H + + 4e - Los pigmentos fotosintéticos principales son las clorofilas, las cuales imparten el color verde a la mayoría de las plantas. Las clorofilas usualmente ocultan otros pigmentos que pueden estar presentes. La clorofila a exhibe un color que fluctúa entre verde intenso y azul verdoso y la clorofila b tiene un color que fluctúa entre amarillo y verde oliva. El color observado es en realidad el que refleja el pigmento al absorberse otros colores, particularmente el rojo y el azul. Además de la clorofila, muchas plantas verdes pueden contener otros pigmentos tales como los carotenos, xantófilas y antocianinas. La cromatografía es una técnica de separación inventada en 1910 por el botánico ruso Mikhail Tswet para separar pigmentos de plantas. La palabra cromatografía se deriva de la palabra en griego para color (croma) y la palabra escritura (grafía). La cromatografía consta de una fase estacionaria tal como el papel o una capa fina de material absorbente, y una fase móvil que típicamente es el disolvente del pigmento. En la cromatografía intervienen los fenómenos de absorción y disolución por lo que hay que tener en cuenta la polaridad, tanto de la sustancia de interés como la del disolvente, si queremos tener una buena separación. Cuanto mayor es la polaridad de los compuestos más intensamente se atraen por el material absorbente si el mismo es polar, como es el caso de la celulosa en papel. La ecuación para determinar la polaridad de diferentes moléculas de pigmentos se llama factor de retención R f : R f = distancia recorrida por el pigmento en cm distancia recorrida por el disolvente Una vez llevada a cabo la cromatografía, se calcula el R f de cada pigmento. Por ejemplo, se mide desde el punto de origen hasta una de las manchas, esa es la distancia hasta esa mancha. La medida desde el mismo punto de origen hasta donde el disolvente dejó de moverse es la distancia del frente del disolvente. Este factor R f establece la relación existente entre la distancia recorrida por el pigmento y la recorrida por el disolvente. Con este propósito se anotará la distancia total que el disolvente se mueve en cm. Esta será la marca en la parte superior del papel de cromatografía. Luego se anotará la distancia en cm que cada pigmento (color) se movió. La ecuación para determinar el valor de R f es: 26

3 El valor de R f para cada pigmento depende de su estructura y es un valor fijo bajo condiciones específicas de temperatura, disolvente y naturaleza química del absorbente. Por ejemplo, a temperatura de salón, con éter de petroleo/acetona en proporción de 92:8 como disolvente y papel cromatográfico Whatman #1, R f de clorofila a es ~0.71 y R f de clorofila b es ~ Materiales Tiras de papel cromatográfico o Whatman #1 1 cm x 15 cm Papel de filtro de cafe Tubos capilares o sorbetos para café Disolvente (92% eter de petroleo, 8% Acetona) o Se puede usar acetone solamente si fuera necesario Vaso de 50 ml o equivalente Vaso alto de 250 ml o equivalente Papel de aluminio Bandas de goma ( rubber bands ) Gafas de seguridad y guantes Regla Preparación Prelaboratorio: El día previo al experimento, se deben cortar hojas de espinaca y colocarlas en un envase de cristal. Se le añade acetona a las hojas hasta cubrirlas para extraerles los pigmentos. Para evitar que la acetona se evapore, se debe tapar el envase. Precaución: La acetona así como las soluciones para separar los pigmentos son inflamables. Mantente alejado de chispas y llamas abiertas. Siempre debes llevar puestas gafas de seguridad. Procedimiento Cromatográfico: 1. Vierte la solución de acetona-espinacas a través de un filtro y recoja el líquido en un vaso de precipitados de 50 ml. 2. Usa guantes para manipular las tiras de papel de cromatografía para evitar que el papel se contamine con los aceites de su piel. Dibuje una línea con lápiz alrededor de 1.5 cm de un extremo de la tira de papel. 3. Utiliza un sorbeto de café para colocar una pequeña gota de la solución verde en el centro de la línea. 4. Asegúrate de que la mancha se seque antes de agregar otra gota. Esto ayudará a 27

4 que la gota no se disperse demasiado. Repita 15 a 20 veces. Tenga cuidado de no dejar que la mancha se disperse mucho. 5. Vierte la solución de la corrida cromatográfica en el vaso de 250 ml de modo que cubra completamente el fondo del mismo. 6. Estira la banda de goma alrededor del vaso de 250 ml a lo largo del mismo pasando sobre la boca y la parte inferior. Esto proporcionará un lugar para colgar la tira de papel cromatográfico. 7. Suspende la tira de papel en el vaso doblando el extremo de la tira alrededor de la banda de goma. 8. El extremo inferior de la tira apenas debe tocar el disolvente. 9. Cubre el vaso con cuidado con papel de aluminio. 10. Observa como los pigmentos por la tira de papel. Después de unos 20 a 30 minutos retira el cromatograma desarrollado. Ten cuidado al manipular el papel por la parte superior solamente. 11. Rápidamente antes de que se seque, marca con un lápiz donde el disolvente se detuvo. Esto se llama el frente del disolvente. 28

5 Datos: Qué observaciones te ayudarán a analizar el cromatograma? Construye una tabla para organizar esas observaciones. Análisis: La relación matemática entre la distancia que viaja un pigmento y la distancia del frente de disolvente se llama el valor R f.. R f = distancia que viaja un pigmento desde el origen distancia que viaja el disolvente desde el origen Calcula los valores de R f para cada uno de los pigmentos separados. Conclusiones: 1. Qué pigmentos pudiste observar en el cromatograma? Cómo puedes determinar que en realidad había éstos en particular? 2. Por qué los pigmentos se mueven a diferentes velocidades a través del cromatograma? 3. Por qué es una ventaja el que las plantas tengan diferentes pigmentos? 4. Con lo que has descubierto acerca de pigmentos vegetales, qué conclusiones se pueden hacer sobre el cambio de color de las hojas en otoño? 5. Piensa en un nuevo experimento que le gustaría tratar de usar para aplicar lo que has aprendido en esta actividad. 29

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