DEPARTAMENTO DE CIENCIAS BASICAS LABORATORIO DE BIOQUÍMICA GUÍA No: 3.2. DETERMINACIÓN DE PROTEINA BRUTA POR EL MÉTODO DE KJELDAHL

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1 1 DEPARTAMENTO DE CIENCIAS BASICAS LABORATORIO DE BIOQUÍMICA GUÍA No: 3.2. DETERMINACIÓN DE PROTEINA BRUTA POR EL MÉTODO DE KJELDAHL I. EL PROBLEMA Determinar el contenido de proteína bruta presente en muestras de harina de pescado, harina de soya y/o harina de trigo comerciales. II. FUNDAMENTO TEÓRICO Como se ha discutido, las proteínas constituyen un grupo de biomeléculas muy importante, puesto que son las responsables de muchas funciones biológicas: Como la formación de tejidos y la actividad enzimática. Conocer los contenidos de proteínas presentes en los tejidos, ha sido objeto de varios estudios y en consecuencia se han desarrollado muchas técnicas de análisis. Existen varios métodos mediante los cuales se puede determinar el contenido de proteína bruta, proteína real y nitrógeno no proteico en muestras tanto de origen vegetal como de origen animal. MÉTODOS ESPECTROFOTOMÉTRICOS Estos métodos son particularmente útiles en la valoración del contenido de proteína real, puesto que se basan en la formación de complejos coloreados entre algunos aminoácidos proteicos ó el enlace peptídico, con reactivos específicos. Dentro de los métodos clásicos están el que emplea el reactivo del biuret, el cual se fundamenta en la formación de un complejo coordinado entre los iones cúpricos del reactivo y el enlace peptídico de la proteína, reacción que transcurre en medio alcalino. También es de uso frecuente el método que emplea la espectrofotometría con base en la reactivo de Folin. En los dos casos anteriores, se elaboran curvas de calibración con una proteína patrón, normalmente la albúmina de huevo o la albúmina bovina estabilizada estándar, y en las mismas condiciones de reacción se hace el desarrollo de la coloración para la muestra que se esté analizando. MÉTODOS VOLUMÉTRICOS Dentro de estos métodos está el de Kjeldahl, el cual se fundamenta en la conversión del nitrógeno total presente en la muestra a sales de amonio que son posteriormente valoradas por volumetría ácido base.

2 2 El método de Kjeldahl consta de tres etapas que en su orden son: digestión de la muestra, destilación con arrastre de vapor del amoniaco producido y valoración ácido base de este amoniaco. En la primera etapa, el hidrógeno y el oxígeno proteico, son oxidados hasta dióxido de carbono y agua, mientras que el nitrógeno es convertido en sulfato de amonio, por la acción de un agente oxidante en medio ácido y con la ayuda de un catalizador. Se han desarrollado diferentes variantes en las cuales cambia el catalizador ó el agente oxidante, pero en todos los casos, el objetivo final de la etapa de digestión es el de convertir el nitrógeno proteico en sulfato de amonio. En la etapa siguiente, mediante la acción de una base fuerte, generalmente hidróxido de sodio al 40%, se libera el amoníaco de la sal de amonio. Cuando la valoración se va a efectuar por retroceso, el amoniaco liberado se arrastra con vapor y se recoge sobre un volumen exactamente medido de un ácido estándar. Una variante utilizada comúnmente, consiste en recibir el amoniaco (hidróxido de amonio) sobre ácido bórico aproximadamente al 4% de tal manera que se forma borato de amonio, el cual se titula directamente. En la etapa final, se hace la valoración de acuerdo con el proceso empleado para la recolección. Así por ejemplo, si el hidróxido de amonio, se recibió sobre un volumen exactamente medido de un ácido estándar, la titulación se hace con una base valorada y en presencia de un indicador adecuado, de tal manera que se determina el ácido que no reaccionó con el hidróxido de amonio destilado y por diferencia, se calcula el hidróxido de amonio producido. En la variante de Steyemark, el hidróxido de amonio se recoge sobre ácido bórico no valorado y luego se titula directamente el borato de amonio que se forma, con un ácido estándar. Reacciones método Kjeldahl Variante Steyemark Digestión: Proteína (s) + H 2 SO 4(c) + Catalizador (s) CO 2(g) + H 2 O (g) + NH 4 HSO 4(ac) Liberación del NH 3 : NH 4 HSO 4(ac) + 2NaOH (ac) NH 3(g) + Na 2 SO 4(ac) + H 2 O (g) Arrastre con vapor: NH 3(g) + H 2 O (g) NH 4 OH (ac) Recolección: NH 4 OH (ac) + H 3 BO 4(ac) NH 4 H 2 BO 4 + H 2 O Titulación: NH 4 H 2 BO 4(ac) + HCI (ac) NH 4 CI (ac) + H 3 BO 4(ac) III. BUSQUEDA DE INFORMACIÓN Elabore el preinforme, según lo pre-establecido desde primer semestre y que contenga los resultados de las siguientes consultas: Composición promedio en porcentaje de carbohidratos, lípidos y proteínas la harina de trigo, harina de pescado y harina de soya. Composición promedio de las diferentes fracciones proteicas que constituyen cada una de las proteínas presentes en cada harina a analizar. Composición promedio en aminoácidos esenciales de cada una de las proteínas a analizar

3 3 IV. MATERIAL EQUIPOS Y RECTIVOS Material biológico: Harina de trigo. Harina de soya Harina de pescado Material y equipo de laboratorio, de uso general Balanza analítica Equipo de digestión y destilación para Kjeldahl Material por grupo de trabajo Balón para kjeldahl 1 Erlenmeyer de 500 ml 1 Probeta de 100 ml 1 Probeta de 200 ml 1 Vidrio de reloj 1 Espátula 1 Reactivos H 2 SO 4 R. A NaOH 40% H 3 BO 4 4% HCI 0.1 N Catalizador en pastillas (de 1 g), que contienen la siguiente mezcla catalizadora: Mezcla catalizadora: K 2 SO 4 97 % CuSO 5H 2 O 1.5 % Selenio 1.5 % Ácido Bórico al 4% con indicador de Tashiro: Preparación. A un litro de ácido bórico al 4% agregar 5 ml de indicador de Tashiro, (que se prepara según se describe a continuación) y ajustar el ph a 4.2 Indicador de Tashiro: Disolver 0. de rojo de metilo y 1 g de verde de bromocresol, en 100 ml de etanol del 96%. V. PROCEDIMIENTO Revisión del equipo VERIFICAR EL BUEN FUNCIONAMIENTO DE TODO EL EQUIPO KJELDAHL, DIGESTOR, EXTRACTOR Y DESTILADOR. LAVAR CON AGUA DESTILADA LOS REFRIGERANTES Y LOS EXTREMOS DE RECOLECCIÓN DEL DESTILADO

4 4 Digestión Pesar con precisión de centésima de gramo, la cantidad de muestra según la siguiente tabla: MUESTRA CANTIDAD EN GRAMOS HARINA DE PESCADO 0.30 HARINA DE SOYA 0.40 HARINA DE TRIGO 0.50 SACAROSA (BLANCO DE REACTIVOS) 0.40 Transferir cada una de las muestras pesadas a sendos balones Kjeldahl previamente marcados. Agregar a cada balón que contiene la correspondiente muestra, 20 ml de H 2 SO 4 R. A Agregar a cada balón2 pastillas de catalizador Colocar los balones que contienen la mezcla de la muestra, el ácido sulfúrico y el catalizador sobre las resistencias del digestor Kjeldahl. Encender las resistencias de calentamiento y el extractor del equipo Kjeldahl ractor. Permitir que transcurra la digestión, vigilando que no haya escape de gases y rotando el balón esporádicamente para facilitar la digestión del material que salta a las paredes, hasta que la mezcla sea transparente. (se toma entre 45 minutos y una hora) Una vez la mezcla este transparente, apagar las resistencias, SIN APAGAR EL EXTRACTOR, y dejar enfriar por 15 minutos en el equipo. Retirar los balones del digestor, y terminar de enfriar cuidadosamente por enfriamiento exterior del balón al chorro de agua. Destilación Una vez frío el contenido del balón, AGREGAR, CUIDADOSAMENTE UTILIZANDO GAFAS Y GUANTES, 200 ml, medidos con probeta, de agua destilada, a cada uno de los balones. Dejar enfriar el balón a temperatura ambiente por 15 minutos. Mientras transcurre este tiempo de enfriamiento, colocar en el extremo de cada destilador, un erlenmeyer de 500 ml de capacidad, al que se le han agregado 100 ml de ácido bórico que contiene el indicador de Tashiro (solución de color rojo vino) Encender las resistencias del destilador Kjeldahl y el sistema de refrigeración Terminar el enfriamiento del balón exteriormente al chorro de agua. Agregar a cada balón, de 10 a 15 perlas para controlar la ebullición Una vez frío el contenido del balón, AGREGAR, CUIDADOSAMENTE UTILIZANDO GAFAS Y GUANTES, 80 ml, medidos con probeta, de solución de NaOH al 40 % Instalar cada balón en una hornilla del destilador, ajustar y agitar. Dejar que transcurra la destilación hasta recoger aproximadamente entre 150 y 200 ml de destilado en erlenmeyer de recolección, cuyo contenido cambia de color a azúl verdoso a medida que se recoge el amoniaco. (se toma aproximadamente de 10 a 15 minutos) Recogido el volumen de destilado mencionado anteriormente, retirar los erlenmeyers colectores. Apagar las resistencias de calentamiento, SIN APAGAR EL SISTEMA DE REFRIGERACIÓNEXTRACTOR. Titulación. Colocar en un erlenemeyer aproximadamente 150 ml de ácido bórico con indicador, que se utilizará como referencia para el color del punto final de la titulación. Titular el contenido de cada destilado con HCl 0.1 N, hasta que el color azul verdoso cambie nuevamente a rojo vino igual al del el erlenmeyer de referencia. Leer y anotar el volumen de HCl gastado en cada titulación.

5 5 VI. TABLAS DE DATOS El estudiante debe elaborar la(s) tabla(s) de datos con base en el (los) procedimiento(s) e incluirla(s) en el preinforme correspondiente. VII. PARA EL ANÁLISIS DE LA PRÁCTICA. Calcular el contenido de proteína, de cada muestra según la siguiente ecuación: % Proteina = V HCl ml x N HCl m.e.q x 14 mg de N x ml x 1 m.e.q x (Peso muestra en mg) Consultar de donde sale el valor 6.25, de la ecuación, que es un factor de conversión de porcentaje de nitrógeno a proteína Consultar otros factores de conversión, de donde salen y cuando se aplican Analizar los resultados obtenidos, por comparación con los niveles promedio de proteína consultados para el preinforme. y evaluar, desde el punto de vista de contenido de proteínas, la calidad nutricional de las muestras analizadas, complementar el análisis con la consulta hecha en el preinforme sobre composición en aminoácidos esenciales Consultar por qué, el valor de proteína, determinado por este método, es de proteína bruta y no de proteína real. Complementar según las instrucciones adicionales del docente. VII. BIBLIOGRAFÍA. - Bernal de Ramírez,I Análisis de alimentos, Academia Colombiana de ciencias exactas, físicas y naturales Colección Julio Carrizosa Valenzuela, No 2. Bogotá. -

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