EL EMPLEO DE ANÁLISIS BIOQUÍMICOS Y MOLECULARES EN EL EXAMEN DHE MOLECULARES EN EL EXAMEN DHE

Transcripción

1 X Curso de Formación sobre la Protección de las Obtenciones Vegetales para Países Iberoamericanos Montevideo (URUGUAY) 12 al 16 de Diciembre de 2011 EL EMPLEO DE ANÁLISIS BIOQUÍMICOS Y MOLECULARES EN EL EXAMEN DHE Luz María a Paz,Laboratorio de Electroforesis (Estación n de Ensayos)-INIA paz@inia.es Luis Salaices, Jefe del Área de Registro de Variedades-OEVV es Estatuto de los caracteres en las Directrices de Examen: - OBLIGATORIOS - NO OBLIGATORIOS - en ANEXO:. Electroforesis

2 es Estatuto de los caracteres en las Directrices de Examen: - ESPECIALES - expresados en respuesta a factores externos: (Resistencia a enfermedades y plagas, reacción a tratamientos químicos) -Componentes químicos: Electroforesis de es Estatuto de los caracteres en las Directrices de Examen: CARACTERES DE ELECTROFORESIS -Consensuar y aprobar el método - Resultados comparables entre laboratorios - Conocimiento claro de la genética que determina el carácter - Sólo como complemento de otras diferencias comprobadas - Empleo de acuerdo con el solicitante de protección o registro

3 es CARACTERES ESPECIALES Documento TGP/12/1 Sección II Componentes químicos: Electroforesis de, se establece lo siguiente: - Se añadirán estos caracteres siempre y cuando satisfagan los criterios que se han adoptado en la UPOV para todo tipo de caracteres. - Se exige también que exista conocimiento claro del control genético de la proteína o en cuestión - Especificar además un método apropiado para el examen es CARACTERES ESPECIALES Documento TGP/12/1 Sección II Componentes químicos: Electroforésis de, se establece lo siguiente: - Estos caracteres se incluyen en un anexo de las directrices de examen, creando así una categoría especial de caracteres. - Se consideran caracteres útiles, pero complementarios de los morfológicos o fisiológicos. Aisladamente no son suficientes para establecer la distinción.

4 es CARACTERES ESPECIALES Posible uso de marcadores genéticos específicos para predecir caracteres tradicionales. es MARCADORES DE PROTEÍNAS La diferente composición n proteica entre dos es es un marcador que puede utilizarse en su diferenciación n y caracterización. Para estudiar la presencia de las distintas que puedan definir a una se utiliza la electroforesis, técnica t con la cual se obtiene una separación n de las mismas que permite su comparación n entre individuos o es en nuestro caso.

5 es ELECTROFORESIS Movimiento de partículas cargadas a través s de un medio poroso por la acción n de un campo eléctrico es ELECTROFORESIS. Solubilizar las de las semillas / plantas. Se cargan según ph del medio en que se solubilizan. Se mueven a través del gel en función de su carga. Se separan por la distinta velocidad con que se mueven: - función de la carga - función del tamaño molecular

6 es ELECTROFORESIS. Se visualizan las separadas, tiñendo con un colorante. Aparecen bandas. Una banda es una proteína o conjunto de que se mueven a la misma velocidad. Diagrama de bandas = Electroforegrama... huella dactilar de la es ALGUNOS TIPOS DE ELECTROFORESIS Soporte Técnica - Almidón - Acrilamida - Agarosa - Clásica: Acid-PAGE y SDS-PAGE - Isoelectroenfoque -Isoenzimas

7 es Disposición ELECTROFORESIS - En placa vertical -Horizontal -En tubo, capilar es ELECTROFORESIS DE ISOENCIMAS EN GELES DE ALMIDÓN PROCESO (germinación n de la semilla)

8 es ELECTROFORESIS EN GELES DE ALMIDÓN Extracción De las isoenzimas es ELECTROFORESIS EN GELES DE ALMIDÓN Gel (preparación, inserción n y corrida)

9 es ELECTROFORESIS EN GELES DE ALMIDÓN Obtención n de láminasl ytinción es ELECTROFORESIS EN GELES DE ALMIDÓN Revelado y Lavado

10 es ELECTROFORESIS EN GELES DE ALMIDÓN Lectura e interpretación n de resultados es ELECTROFORESIS EN GELES DE ALMIDÓN Lectura e interpretación n de los electroforegramas

11 es METODOLOGÍA EMPLEADA EN NUESTRO LABORATORIO La electroforesis se utiliza tanto en las tareas de Certificación n como de Registro. Así se trabaja de forma rutinaria en trigo, cebada, avena, girasol, maíz, aunque hay técnicas t puestas a punto o disponibles para hacerlo en algunas otras especies. Ejemplo: En el caso del girasol y maíz, se utiliza la electroforesis para determinar y comprobar la fórmula f del híbrido, h sin tener que recurrir a la producción n del mismo en campo a partir sus parentales (sólo se recurre a este cruzamiento cuando los resultados en electroforesis dicen que el híbrido h no está bien formado). es METODOLOGÍA EMPLEADA EN NUESTRO LABORATORIO En cuanto a los métodos m empleados: Recogidos en las Directrices de la UPOV para cada cultivo, cuando los hay. Así en el trigo empleamos las técnicas t de ACID-PAGE y SDS- PAGE (en gliadinas y gluteninas respectivamente); en cebada las de ACID-PAGE y SDS-PAGE en hordeínas; en avenas, ACID- PAGE en aveninas; ; en el caso de girasol y maíz,, isoenzimas en almidón. Sin embargo, muchas otras especies no tienen método m consensuado por la UPOV, se ha empezado a trabajar en electroforesis de diversa especies.

12 es TÉCNICAS DE ADN -Técnicas que produzcan resultados reproducibles entre laboratorios Se descartan técnicas poco reproducibles (RAPD s), o que supongan pago de patentes (AFLP s) Uso de microsatélites cade vez más generalizado, suficientemente reproducibles (aunque su utilización presuponga un conocimiento previo del genoma) o con SNP s. es TÉCNICAS DE ADN Todas estas técnicas t se basan en la Reacción n en cadena de la polimerasa (PCR) Hacer muchas copias de un fragmento de ADN que nos interese y visualizarlas: - Separar en gel de agarosa o acrilamida, teñir con bromuro de etidio o plata. Ver como bandas - Separa los fragmentos en un secuenciador (gel capilar), macando con fluorocromos. Leer como picos

13 es TÉCNICAS DE ADN es TÉCNICAS DE ADN ALGUNAS TÉCNICAS BASADAS EN LA PCR: RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphisms) Microsatélites o SSR (Simple Sequence Repeats) Marcadores basados en polimorfismos de nucleótidos simples SNP (Single Nucleotide Polimorphysms)

14 Gracias