Marcadores moleculares

Transcripción

1 BIOTECNOLOGÍA VEGETAL 2011 Marcadores moleculares Lorena Norambuena Facultad de Ciencias, Universidad de Chile

2 Organismo Set de Genes Variabilidad genética

3 Organismo Set de Genes Variabilidad genética Polimorfismo: variación en la secuencia del ADN entre dos individuos, modifiquen o no éstas su fenotipo

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5 Polimorfismo

6 Qué es un marcador? Marcadores moleculares Un marcador es un carácter que debido al ligamiento puede usarse para indicar la presencia de una caracteristica Característica A Gen Proteína Tipo de hoja que esté asociada a la presencia o expresión de una Característica B Vigor Altura Enfermedades La presencia de A necesariamente implica la de B

7 Marcador Morfológico Son características fenotípicas de fácil identificación visual Por ejemplo forma, color, tamaño o altura Desventajas: Pequeño número de ellos Poseen bajo polimorfismo comparado con marcadores moleculares

8 Marcadores moleculares Característica A Gen Proteína Tipo de hoja que esté asociada a la presencia o expresión de una Característica B Vigor Altura Enfermedades La presencia de A necesariamente implica la de B

9 Marcador molecular - Polimórfico - Herencia mendeliana (no epistática, sin interacción entre genes) - Insensible a los efectos ambientales - Codominante - Rápida identificación y simple análisis Codominancia un individuo heterocigoto presentará las características de ambos alelos Epistasis interacción génica de diferentes loci para una una caracteristica dada

10 Marcador Bioquímico La mayor desventaja de este /po de marcador es que son limitados en número y que su expresión depende del tejido analizado y del estado de desarrollo de la planta. Isoenzimas Variantes de una misma enzima que comparten un sustrato en común pero difieren en su punto isoeléctrico y por ende en su movilidad electroforé/ca en un isoelectroenfoque (gradiente de ph) Fueron los primeros marcadores no morfológicos usados en gené/ca de plantas.

11 Isoenzimas

12 Análisis Revelado especifico para ac5vidad enzima5ca

13 Figure 1. Different electrophoretic patterns (Pi) observed for isoenzymes isocitrate dehydrogenase (IDH), phospho-glucoisomerase (PGI), â- esterase (â-est I and â-est II) and acid phosphatase (ACP) in cycle 0 of rice population PFD-1, and four commercial rice cultivars Araure 4,Cimarrón, Fonaiap 1 and Palmar Tomado desde CHAPTER 5 Molecular Markers as Tools for Rice Population Improvement. Catalina Ramis, Ana Cláudia de Carvalho Badan, Elcio Perpétuo Guimarães, Antonio Díaz, Carlos Eduardo Gamboa

14 Marcador Moleculares DNA Secuencias de DNA que permiten evidenciar variaciones entre individuos USOS - Verificación de la pureza de los cul/vares. Especialmente u/lizado por empresas para la validación de caracteres de interés. - Caracterización de germoplasma. - Estudios filogené/cos. - Mejoramiento gené/co a través de Marker Assisted Selec/on y la construcción de Mapas de Ligamiento.

15 RFLP Restriction Fragment Length Polymorphisms Longitud de los fragmentos obtenidos por el corte del DNA Como se generan las sondas: Transcripcion reversa de mrna generando una colección de cdna Librería genómica Genomas secuenciados, amplificacion via PCR secuencias conocidas Limitaciones: Trabajoso Se necesita disponer de una colección de sondas Se requiere de alta cantidad de DNA genómico

16 Sickle cell anemia Condicion medica trasmitida de padres a hijos en la cual los globulos rojos son de forma curva lo que produce dolor y fiebre. Se encuentra especialmente en la raza negra. Es causada por una mutación en el gen de la globina En 1978 Kan & Dozy (UC San Francisco) reporto que el sitio de restriccion HpaI estaba asociado con SCA. Este polimorfismo podria ser usado para diagnostico 60% de los individuos de raza negra con hemoglobina S tienen un fragmento de restriccion 13 kb. Los que tienen hemoglobina normal tienen un fragmento de restriccion de 7.6 kb (US) * La utilidad de este ensayo es limitada ya que en gente de otras partes del mundo la enfermedad puede asociarse a ambos fragmentos

17 Hemoglobin A tiene un sitio MstII en los codones 5 to 7 Un cambio de A a T elimina el sitio en hemoglobin S N: puede ser cualquier nucleotido Hemoglobina S Southern blot Como el sitio de restricción reconoce la mutación este test da un diagnóstico correcto en 100% de los casos

18 Minisatelites Loci hipervariable = minisatelites = VNTR VNTR: variable number tandem repeats Secuencias adyacentes que se repiten en numero variable pb que se repiten hasta 50 veces Los minisatelites estan dispersos por todo el genoma Cada loci posee distinto número de repeticiones Han sido usados en: Identificacion de diversidad y determinación de variedades y cultivares en planta Análisis de diversidad y determinación de paternidad Técnicamente los polimorfismos de VNTR es similar al RFLP Una proporción del genoma de organismos eucariontes esta compuesta de secuencias repetitivas 30% DNA Drosophyla 70% tabaco 50% Arroz

19 Análisis de minisatélites o VNTR Southern blot H1 Hinfl H3 HaeIII Caja negra muestra donde la sonda radioactiva se une

20 DNA fingerprinting Huella genética es una técnica utilizada para distinguir entre los individuos de una misma especie utilizando muestras de su DNA.

21 History of DNA fingerprinting and RFLP Because DNA has all of the information to define who we are, our DNA can be used as a unique means of identifying us. The first method that used DNA as a means of fingerprinting was presented in 1985 in the journal Nature. This method, dominant for the next ten years, was called restriction fragment length polymorphism or RFLP. RFLP takes advantage of the fact that there is a copy of DNA in each cell and typically a forensic sample has many cells. A type of chemical called a restriction enzyme is applied to chop up the DNA into smaller fragments. It makes its cuts at specific sequences of nucleotides. These fragments have different sizes and this variation is called polymorphism. To continue the above analogy, let's pretend the following sentences represent DNA from two different people. Criminalistica RFLP fragments separated on a gel In this case the sample from the crime scene matches suspect B

22 DNA fingerprinting The analysis might be specific enough that only 1 person in 20 billion people would have the same pattern, indicating an almost definite match.

23 PCR Fue desarrollada a mediado de la decada de los 80 s Se amplifican secuencias de DNA Se requiere una pequeña cantidad de templado para obtener cantidades suficientes de DNA que se pueden observar utilizando bromuro de etidio Uno de los requerimientos es conocer las secuencias que flanquean la sequencia a amplificar Marcadores basados en PCR

24 RAPD Random Amplification of Polymorphic DNA Se usan primers cortos de secuencia arbitraria Las secuencias complementarias deben estar a <4000 pb y en orientacion opuesta La secuencia blanco es desconocida

25 RAPD Random Amplification of Polymorphic DNA Permite la realización de análisis genéticos de especies de genomas no conocidos Fingerprinting individuos, variedades y poblaciones Análisis de estructura y diversidad genética en poblaciones naturales Relaciones filogenéticas entre distintas especies Construcción de mapas genéticos Ventajas Análisis es mas rapido No se requiere un banco de secuencias El mismo conjunto de partidores puede ser usado para distintos organismos Limitaciones Los genotipos heterocigotos no pueden ser discriminados de los homocigotos

26 Significance of Lactobacilli in Cheddar Cheese 18 mature Cheddar cheeses, from 7 commercial companies were selected for analysis RAPD was investigated as a suitable method to determine the number of strains of lactobacilli isolated from the commercial Cheddar cheeses. In summary these studies found that one species of lactobacilli (Lb. paracasei) was the dominant non-starter lactic acid bacteria in mature Cheddar cheese. Although a wide variety of strains were identified, only a few were found in any particular cheese, suggesting their likely role in cheese flavour diversity even within the same manufacturing plant. This suggests the potential for flavour control or enhancement through the selective and controlled use of non-starter lactic acid bacteria.

27 Microsatelites Microsatellites Polymorphism SSR: simple sequence repeats STR: short tandem repeats Consisten en secuencias de 1-4 nucleotidos adyacentes repartidas Puden ser utilizados para generar mapas genéticos de especies Se diseñan primer especificos que flanquean el microsatelite Se requiere de un método de separación de los amplificados de alta resolucion

28 SSRs: Son las semillas de variedades distintas? S1 S2 S3 DNA extrac5on: separate proteins, precipitate DNA, wash DNA, resuspend DNA PCR PCR PCR S1 S2 S3 S1 S2 S3 Gel de poliacrilamida TCAGA 2 REPEATS 3 REPEATS 4 REPEATS Por lo tanto estas semillas presentan un polimorfísmo en la zona amplificada

29 Microsatelites Microsatellites Polymorphism SSR: simple sequence repeats STR: short tandem repeats Consisten en secuencias de 1-4 nucleotidos adyacentes repartidas Puden ser utilizados para generar mapas genéticos de especies Se diseñan primer especificos que flanquean el microsatelite Se requiere de un método de separación de los amplificados de alta resolucion Ventajas SSR son los que contienen el mas elevado contenido de informacion de poimorfismo, por esta razon esencialmente toda y cualquier poblacion segregante puede ser utilizada como poblacion de referencia para estudios de ligamiento y mapeo genetico

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31 Microsatelites Criminalistica Seis STR (short tandem repeats) fueron analizados

32 Microsatelites Desventaja: Arduo trabajo en el diseño de ellos DNA genomico cortado con enzimas de restriccion Construccion de una genoteca de fragmentos pequeños Seleccion de colonias con sonda complementaria. Sonda de oligo (GT) para microsatelites CA Colonias positivas secuenciadas para verificar la extension del microsatelite Seleccion de clones con por lo menos (CA)8 Secuenciamiento completo de clones diseno y sintesis de primer verificar el polimorfismo de los segmentos amplificados

33 AFLP Amplified Fragment Length Polymorphism SSLP : Simple Sequence Length Polymorphisms Son muy similares al concepto de RFLP pero utilizan la reacción de PCR Otros AFLP SFP: Single Feature Polymorphism SNP: Single Nucleotide Polymorphism

34 CAPS, Cleaved amplify polimorphic sequences Plant journal (2): 403

35 Desarrollo de marcadores moleculares Ejemplo CAPS, Cleaved amplify polimorphic sequences A. thaliana cuando su genoma aun no era secuenciado totalmente Identificacion de un set de genes que ya estaban mapeados y secuenciados Diseño de primers para amplificar esas regiones Se amplifican los correspondientes fragmentos de dos variedades de A. thaliana Para identificar RFLP cada fragmento fue analizado por digestion con enzimas de restriccion hasta encontrar polimorfismo Plant journal (2): 403

36 CAPS, Cleaved amplify polimorphic sequences Plant journal (2): 403

37 Densidad de marcadores moleculares en Arabidopsis thaliana

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39 Resumen: - Pueden ser evaluados desde los primeros estados de desarrollo de las plántulas (evaluación de semillas). - Son aplicables a cualquier /po de material vegetal. - Son independientes de la época del año en que se realiza el análisis y de los efectos que el medio ambiente puede causar sobre el feno/po. - Permiten la iden/ficación correcta de la variedad sin necesidad de muchos caracteres. - Permiten la selección de caracterís/cas que se hereden poco. - Permiten seleccionar caracterís/cas cuando la evaluación del feno/po no es posible. - Presentan mayor polimorfismo que los morfológicos (varios alelos pero solo algunos con feno/po evidente).

40 Mapas de Ligamiento o gené5cos Indican la posición y la distancia gené5ca rela5va entre marcadores a lo largo del cromosoma en cm Basados en la recombinación gené5ca Responden la pregunta: Cuán cerca está el marcador del gen de interés o de otro marcador?

41 Construcción de un Mapa de Ligamiento: Qué distancia separa a E, F. G y H? Cuatro zonas polimorficas dadas por ej por 4 pares de primer para RAPD En el 94.1% de la descendencia E segrega junto con F. Solo en el 85.6% E segrega junto con H

42 Mapas de ligamiento NN nn X Ea: ecotipo a Mutante Eb: ecotipo b NN Nn nn nn M: mezcla Ea+Eb

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44 P1: planta1 P2: planta2 P3: planta3 Ea: ecotipo a Eb: ecotipo b M: mezcla Ea+Eb P1 P2 P3 Ea Eb M P1 P2 P3 Ea Eb M P1 P2 P3 Ea Eb M P1 P2 P3 Ea Eb M CIW4 nga280 ctr1 CIW8

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