Caracterización por Real-Time PCR: algunas aplicaciones en genética animal. Dr. Ruben Pérez

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Juan Francisco Caballero Rojo
hace 8 años
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1 Caracterización por Real-Time PCR: algunas aplicaciones en genética animal Dr. Ruben Pérez

2 CARACTERIZACIÓN POR REAL-TIME PCR DIAGNÓSTICO: PRESENCIA/AUSENCIA AMPLICÓN Real Time PCR CARACTERIZACIÓN DEL AMPLICÓN CUANTIFICACIÓN RELATIVA O ABSOLUTA

3 CARACTERIZACIÓN DE AMPLICONES Obtener información sobre la secuencia nucleotídica subyacente. Caracterización Secuenciación RFLP

4 DETECCIÓN DE SNP Ejemplo más simple: un gen con dos alelos que difieran en una única base Agentes intercalantes Diferenciación por curvas de melting Sondas de hidrólisis (MGB-Taqman)

5 EJEMPLOS

6 RIÑON POLIQUÍSTICO EN GATOS ENFERMEDAD DOMINANTE QUE SE MANIFIESTA TARDIAMENTE AA MUEREN Aa ENFERMOS aa SANOS EL GEN CODIFICA PARA UNA PROTEÍNA DE MEMBRANA EL ALELO A TIENE UNA MUTACIÓN EN SOLA BASE QUE GENERA UN CODON STOP

EL GEN CODIFICA PARA UNA PROTEÍNA DE MEMBRANA EL ALELO

7 PKD EN GATOS Alelo normal (a) mutación Alelo mutante (A) PCR ELECTROFORESIS EN GEL

8 RFLP ALELO NORMAL LA NUEVA SECUENCIA ES RECONOCIDA POR UNA ENZIMA DE RESTRICCIÓN ALELO MUTANTE + ENZIMA DE RESTRICCIÓN + ENZIMA DE RESTRICCIÓN = = RFLP

9 GENOTIPOS aa Aa Aa aa aa AA Aa

10 Agentes intercalantes Diferenciación por curvas de melting

11 Sondas de hidrólisis (MGB-Taqman)

12 MINOR GROOVE BINDER (MGB) PROBES sondas con ligandos de unión al surco menor (MGB) del ADN

14 VENTAJAS MGB Las sondas MGB forman duplexs más estabilizados (mayor Tm). Una secuencia de 15 mer tiene una Tm de 60ºC, mientras que un duplex nomodificatido tiene una de 42. Se puede reducir el tamaño (12 a 20 mer). Mejor acción del quencher (menor fluorescencia residual). Mejor discernimiento de SNP. Mismatch dentro de la región de unión son especialmente desestabilizadores. Por eje. Un mismatch T/G en la región MGB tiene una delta tm de 15 grado, en comparación de 6º en la región no-mgb. La adición de un MGB cerca del extremo rico en AT, contribuye con tanta estabilidad como la adición de 15 bases.. Las sondas no-mgb tiene una diferencia de 4-6 C.

Mejor acción del quencher (menor fluorescencia residual). Mejor discernimiento de SNP. Mismatch dentro de la región de unión son especialmente desestabilizadores.

15 Optimal Design Applied Biosystems Custom TaqMan MGB Probes incorporate a 5 reporter dye and a 3 non-fluorescent quencher (NFQ). The NFQ offers the advantage of lower background signal, which results in better precision in quantitation. The MGB moiety stabilizes the hybridized probe and effectively raises the melting temperature (Tm). This means MGB probes can be shorter than traditional duallabeled probes, which makes them better suited for allelic discrimination applications. Custom TaqMan MGB probes are available with the following reporter dyes; Fam, Vic, TET, and NED. All TaqMan probes are purified. Design Custom TaqMan MGB Probes for any species, splice variant, or novel gene.

The MGB moiety stabilizes the hybridized probe and effectively raises the melting temperature (Tm).

16 PARVOVIRUS CANINO Genoma pequeño (5.2 Kpb) de ADN simple hebra que codifica proteínas no estructurales (NS) y proteínas estructurales (VP)

17 La cápside está constituida por las proteínas estructurales VP

18 PANDEMIA 426 Asn

19 Caracterizar las cepas de campo Cepa 426 CPV-2A AAT Asparagina (Asn, N) CPV-2B GAT Aspartato (Asp, D) CPV-2C GAA Glutamato (Glu, E) SECUENCIACIÓN GENERA SITIO DE CORTE MBOII

20 Diferenciación de cepas de campo

21 SE REQUIEREN SONDAS ESPECÍFICAS PARA CADA VARIANTE GÉNICA---- Cepa 426 CPV-2A AAT Asparagina (Asn, N) CPV-2B GAT Aspartato (Asp, D) CPV-2C GAA Glutamato (Glu, E)

22 ALTERNATIVAS PARA EL DIAGNÓSTICO UTILIZANDO SONDAS TAQMAN Si las variantes génicas a identificar son lo suficientemente distintas puede utilizarse sondas taqman y primers específicos para la variante. Si existen muchas variantes hay que plantearse la identificación de variantes relevantes (por ej. patogénicas)

23 VIRUS DE LA INFLUENZA AVIAR Familia :Orthomyxoviridae Género : Influenzavirus tipo A Virus RNA Envuelto 8 segmentos

24 Los genes de la proteína Matriz (M) y de la nucleoproteína (M gene) se hallan muy conservados en la AIV tipo A Los genes de las glicoproteínas de superficie (Hemaglutinina, HA y Neuroaminidasa, NA) permiten caracterizar los subtipos de AIV Existen 16 tipos de HA y 9 tipos de NA

25 DIAGNÓSTICO CARACTERIZACIÓN Identificación de los subtipos H5 y H7 que son los que sueles estar relacionados con alta patogenicidad en aves DISEÑO DE UN SISTEMA BASADO EN SONDAS TAQMAN PARA LA IDENTIFICACIÓN DE LOS SUBTIPOS

26 H5

27 H7

34 ESTAMOS TRABAJANDO EN: Distemper canino (CDV) Gumboro (IBDV) Bronquitis infecciosa aviar (IBV) PKD en gatos Campylobacter en bovinos

35 MUCHAS GRACIAS!!!! Grupo de investigación Facultad de Ciencias

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