Applied Biosystems StepOne Real-Time PCR System. Guía de reactivos

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1 Applied Biosystems StepOne Real-Time PCR System Guía de reactivos

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3 Applied Biosystems StepOne Real-Time PCR System Guía de reactivos

4 Copyright 2006, 2010 Applied Biosystems. All rights reserved. Information in this document is subject to change without notice. Applied Biosystems assumes no responsibility for any errors that may appear in this document. APPLIED BIOSYSTEMS DISCLAIMS ALL WARRANTIES WITH RESPECT TO THIS DOCUMENT, EXPRESSED OR IMPLIED, INCLUDING BUT NOT LIMITED TO THOSE OF MERCHANTABILITY OR FITNESS FOR A PARTICULAR PURPOSE. IN NO EVENT SHALL APPLIED BIOSYSTEMS BE LIABLE, WHETHER IN CONTRACT, TORT, WARRANTY, OR UNDER ANY STATUTE OR ON ANY OTHER BASIS FOR SPECIAL, INCIDENTAL, INDIRECT, PUNITIVE, MULTIPLE OR CONSEQUENTIAL DAMAGES IN CONNECTION WITH OR ARISING FROM THIS DOCUMENT, INCLUDING BUT NOT LIMITED TO THE USE THEREOF. NOTICE TO PURCHASER: Label License The StepOne Real-Time PCR System is covered by US patents and corresponding claims in their non-us counterparts, owned by Applied Biosystems. No right is conveyed expressly, by implication, or by estoppel under any other patent claim, such as claims to apparatus, reagents, kits, or methods such as 5 nuclease methods. Further information on purchasing licenses may be obtained by contacting the Director of Licensing, Applied Biosystems, 850 Lincoln Centre Drive, Foster City, California 94404, USA. NOTICE TO PURCHASER: PLEASE REFER TO THE USER'S GUIDE OR PRODUCT INSERT OF THE REAGENTS NAMED HEREIN FOR LIMITED LABEL LICENSE OR DISCLAIMER INFORMATION. TRADEMARKS: Applera, Applied Biosystems, AB (Design), MicroAmp, Primer Express, and VIC are registered trademarks, and FAM, JOE, MultiScribe, NED, ROX, StepOne, TAMRA, and TET are trademarks of Applied Biosystems or its subsidiaries in the U.S. and/or certain other countries. AmpErase, AmpliTaq Gold, and TaqMan are registered trademarks of Roche Molecular Systems, Inc. SYBR is a registered trademark of Molecular Probes, Inc. All other trademarks are the sole property of their respective owners. Número de referencia Rev. B 06/2010

5 Contenido Front Cover Prólogo Cómo utilizar esta guía vii Cómo obtener más información ix Cómo obtener asistencia técnica xi Capítulo 1 Introducción Acerca del sistema StepOne Preparación de experimentos en el sistema StepOne Selección del tipo de experimento Selección del tipo de reactivo Selección del tipo de ensayo Capítulo 2 Introducción a los reactivos Introducción Reactivos TaqMan Reactivos SYBR Green Selección del tipo de reactivo apropiado Reducción al mínimo de los contaminantes del DNA Capítulo 3 Experimentos de cuantificación Sección 3.1: Acerca de los experimentos de cuantificación Introducción Selección de un método de cuantificación Selección de una RT-PCR de 1 o 2 pasos Selección de PCR en singleplex o en multiplex Selección del tipo de reactivo Selección del tipo de ensayo Sección 3.2: Directrices de diseño Ensayos en inventario/fabricados bajo pedido TaqMan Gene Expression Assays Custom TaqMan Gene Expression Assays iii

6 Selección de la mezcla de reacción Diseño del experimento Ensayos personalizados Diseño de cebadores y sondas con el software Primer Express Selección de reactivos Uso de las condiciones de termociclado recomendadas Optimización de concentraciones de cebador Optimización de la concentración de sonda Para obtener más información Capítulo 4 Experimentos de genotipado Sección 4.1: Acerca de los experimentos de genotipado Introducción Selección del tipo de ensayo Sección 4.2: Directrices de diseño Ensayos prediseñados/validados TaqMan SNP Genotyping Assays TaqMan Drug Metabolism Genotyping Assays Pre-Developed TaqMan Assay Reagents for Allelic Discrimination Selección de la mezcla de reacción Diseño del experimento Ensayos personalizados Custom TaqMan SNP Genotyping Assays Selección de la mezcla de reacción Diseño del experimento Capítulo 5 Experimentos de presencia/ausencia Sección 5.1: Acerca de los experimentos de presencia/ausencia Introducción Selección del tipo de ensayo Sección 5.2: Directrices de diseño Ensayos en inventario/fabricados bajo pedido TaqMan Gene Expression Assays Custom TaqMan Gene Expression Assays TaqMan Exogenous Internal Positive Control Reagents Selección de la mezcla de reacción Diseño del experimento Ensayos personalizados iv

7 Apéndice A Fórmula Fórmula para experimentos de C T comparativos ( C T ) A-1 Apéndice B Limitación del cebador en la PCR en multiplex Apéndice C Directrices de diseño de ensayos Bibliografía Glosario Índice v

8 vi

9 Prólogo Cómo utilizar esta guía Finalidad de esta guía Público Suposiciones Convenciones del texto Palabras de aviso para el usuario En esta guía, se proporciona información acerca de los reactivos que se pueden utilizar en Applied Biosystems StepOne Real-Time PCR System (sistema StepOne ). Información de esta guía: Introducción a los reactivos TaqMan y SYBR Green Descripciones y directrices de diseño para los siguientes tipos de experimentos: Experimentos de cuantificación Experimentos de genotipado Experimentos de presencia/ausencia Esta guía está destinada al personal de laboratorio y a los principales investigadores que realizan experimentos de curva estándar con el sistema StepOne. En esta guía, se asume lo siguiente: Tiene un conocimiento práctico del proceso de reacción en cadena de polimerasa (PCR). Sabe manejar muestras de DNA y/o RNA y prepararlas para la PCR. En esta guía, se utilizan las siguientes convenciones: El texto en negrita indica una acción del usuario. Por ejemplo: Escriba 0 y, a continuación, pulse Intro en cada uno de los campos restantes. El texto en cursiva señala palabras nuevas o importantes y también se utiliza para enfatizar algo. Por ejemplo: Antes de realizar el análisis, prepare siempre una matriz fresca. El símbolo de la flecha que apunta a la derecha ( ) separa los comandos sucesivos que se seleccionan en un menú desplegable o un menú de acceso directo. Por ejemplo: Seleccione File (Archivo) Open (Abrir). En la documentación de Applied Biosystems, aparecen dos palabras de aviso para el usuario. Cada palabra implica un nivel concreto de observación o acción, tal y como se describe a continuación: Nota: Proporciona información que puede ser interesante o útil, pero no es esencial para el uso del producto. IMPORTANTE! Proporciona información que es necesaria para poder utilizar el instrumento correctamente, para poder utilizar un kit de reactivos con precisión o para poder utilizar un producto químico de manera segura. vii

10 Prólogo A continuación, se muestran algunos ejemplos de palabras de aviso para el usuario: Nota: La función de calibración también está disponible en la consola de control. IMPORTANTE! Para comprobar la conexión del cliente, necesita un identificador de usuario válido. Palabras de aviso de seguridad En la documentación del usuario de Applied Biosystems, aparecen cuatro palabras de aviso de seguridad en los puntos del documento en los que debe conocer la existencia de peligros importantes. Cada palabra de aviso (IMPORTANTE, PRECAUCIÓN, ADVERTENCIA, PELIGRO) implica un nivel de observación o acción particular, tal y como se explica a continuación. Definiciones IMPORTANTE! Proporciona información que es necesaria para poder utilizar el instrumento correctamente, para poder utilizar un kit de reactivos con precisión o para poder utilizar un producto químico de manera segura. Indica una situación potencialmente peligrosa que, de no evitarse, podría causar lesiones leves o moderadas. También puede utilizarse para alertar de prácticas no seguras. Indica una situación potencialmente peligrosa que, de no evitarse, podría causar lesiones graves o mortales. Indica una situación inminentemente peligrosa que, de no evitarse, tendrá como resultado lesiones graves o mortales. Esta palabra de aviso se limita a las situaciones más extremas. A excepción de los avisos IMPORTANTE, todas las palabras de aviso de seguridad de un documento de Applied Biosystems aparecen con la figura de un triángulo abierto que contiene un símbolo de peligro. Estos símbolos de peligro son idénticos a los que se incorporan en los instrumentos de Applied Biosystems. Ejemplos IMPORTANTE! Debe crear una hoja de cálculo de entradas de muestras diferente para cada placa de reacción de 96-pocillos. PELIGRO QUÍMICO. TaqMan Universal PCR Master Mix puede causar irritaciones en la piel y los ojos. Puede provocar molestias si se ingiere o se inhala. Consulte la ficha técnica de seguridad (MSDS) y siga las instrucciones de manipulación indicadas. Use protectores oculares, vestimenta protectora y guantes apropiados. PELIGRO DE LESIONES FÍSICAS. Durante el uso de los instrumentos, la cubierta caliente y el bloque de muestras pueden alcanzar temperaturas superiores a 100 C. PELIGRO ELÉCTRICO. La continuidad del circuito de toma a tierra es vital para la seguridad. Jamás utilice el sistema con el conductor de toma de tierra desconectado. viii

11 Prólogo Cómo obtener más información Documentación relacionada El sistema StepOne incluye la siguiente documentación: Documento Núm. ref. inglés Núm. ref. español Applied Biosystems StepOne Real-Time PCR System Getting Started Guide for Genotyping Experiments Applied Biosystems StepOne Real-Time PCR System Getting Started Guide for Presence/Absence Experiments Applied Biosystems StepOne Real-Time PCR System Getting Started Guide for Relative Standard Curve and Comparative C T Experiments Applied Biosystems StepOne Real-Time PCR System Getting Started Guide for Standard Curve Experiments Applied Biosystems StepOne Real-Time PCR System Installation, Maintenance, and Networking Guide Applied Biosystems StepOne Real-Time PCR System Installation Quick Reference Card Applied Biosystems StepOne Real-Time PCR System Site Preparation Guide Applied Biosystems StepOne Real-Time PCR System Software Help ix

12 Prólogo Applied Biosystems puede proporcionarle la siguiente documentación auxiliar: Documento Applied Biosystems High-Capacity cdna Reverse Transcription Kits Protocol Applied Biosystems StepOne Real-Time PCR System Installation Performance Verification Protocol Applied Biosystems StepOne Real-Time PCR System Installation Qualification-Operation Qualification Protocol Applied Biosystems StepOne Real-Time PCR System Planned Maintenance Protocol Número de referencia Custom TaqMan Gene Expression Assays Protocol Custom TaqMan Genomic Assays Protocol: Submission Guidelines Custom TaqMan SNP Genotyping Assays Protocol Power SYBR Green PCR Master Mix and RT-PCR Protocol Pre-Developed TaqMan Assay Reagents Allelic Discrimination Protocol Primer Express Software Version 3.0 Getting Started Guide SYBR Green PCR and RT-PCR Reagents Protocol SYBR Green PCR Master Mix and RT-PCR Reagents Protocol TaqMan Drug Metabolism Genotyping Assays Protocol TaqMan Exogenous Internal Positive Control Reagents Protocol TaqMan Fast Universal PCR Master Mix (2 ) Protocol TaqMan Gene Expression Assays Protocol TaqMan SNP Genotyping Assays Protocol TaqMan Universal PCR Master Mix Protocol User Bulletin #2: Relative Quantitation of Gene Expression Using TaqMan Endogenous Control Assays to Select an Endogenous Control for Experimental Studies Application Note 127AP08 Nota: Para obtener más documentación, consulte Cómo obtener asistencia técnica en la página xi. Obtención de información de la ayuda del software En Applied Biosystems StepOne Real-Time PCR System Software (software StepOne ) Help, se describe cómo se utiliza cada función de la interfaz de usuario. Para acceder a la ayuda desde el software StepOne, realice una de las siguientes acciones: Pulse F1. Haga clic en en la barra de herramientas. x

13 Prólogo Seleccione Help (Ayuda) StepOne Help (Ayuda de StepOne). Para buscar temas de interés en la ayuda: Consulte el índice de contenido. Busque un tema específico. Busque en un índice alfabético. Envíenos sus comentarios Applied Biosystems agradece sus comentarios y sugerencias para mejorar sus documentos de usuario. Puede enviar sus comentarios a la dirección de correo electrónico: techpubs@appliedbiosystems.com IMPORTANTE! Esta dirección sólo sirve para enviar comentarios y sugerencias en relación con la documentación. Para solicitar documentos, descargar archivos PDF u obtener ayuda sobre una cuestión técnica, vaya a y, a continuación, haga clic en el vínculo Support (Asistencia técnica). (Consulte Cómo obtener asistencia técnica más adelante.) Cómo obtener asistencia técnica Para acceder a los servicios más recientes y obtener información acerca de la asistencia técnica, vaya a y, a continuación, haga clic en el vínculo Support (Asistencia técnica). En la página Support (Asistencia técnica), puede: Buscar las preguntas más frecuentes (FAQ) Enviar una pregunta directamente al Servicio de asistencia técnica Solicitar a Applied Biosystems documentos de usuario, fichas técnicas de solicitud de materiales (MSDS), certificados de análisis y otros documentos relacionados Descargar documentos PDF Obtener información acerca de la formación del cliente Descargar actualizaciones y parches de software Asimismo, en la página Support (Asistencia técnica) podrá acceder a los números de teléfono y fax para ponerse en contacto con el Servicio de asistencia técnica y las instalaciones de venta de Applied Biosystems en todo el mundo. IMPORTANTE! Cuando se le solicite que lo haga en esta guía o cuando tenga que programar el mantenimiento del instrumento StepOne (por ejemplo, el mantenimiento anual planificado o la verificación/calibración de la temperatura), póngase en contacto con el Centro de atención al cliente de Applied Biosystems. Para obtener un número de teléfono o enviar un mensaje de correo electrónico al centro, visite xi

14 Prólogo xii

15 Introducción 1 1 Este capítulo cubre los siguientes temas: Acerca del sistema StepOne Preparación de experimentos en el sistema StepOne Selección del tipo de experimento Selección del tipo de reactivo Selección del tipo de ensayo

16 Capítulo 1 Introducción Acerca del sistema StepOne Applied Biosystems StepOne Real-Time PCR System (sistema StepOne ) utiliza reactivos de reacción en cadena de polimerasa (PCR) basados en fluorescencia para proporcionar: Detección cuantitativa de las secuencias de ácido nucléico de diana (dianas) mediante análisis en tiempo real. Detección cualitativa de secuencias de ácido nucléico de diana (dianas) mediante análisis de punto final y curva de disociación. Acerca de la recogida de datos El sistema StepOne recoge datos de fluorescencia brutos en diferentes puntos de una PCR, dependiendo del tipo de proceso que realice: Tipo de proceso Punto de recogida de datos Procesos en tiempo real Procesos de punto final Curva estándar Curva estándar relativa C T comparativos ( C T ) Genotipado Presencia/ausencia El instrumento recoge datos después de cada paso de extensión de la PCR. El instrumento recoge datos antes y después de la PCR. El instrumento también puede recoger datos durante el proceso (en tiempo real), lo que puede resultar útil para solucionar los problemas. El instrumento recoge datos antes y después de la PCR. Con independencia del tipo de proceso que se realice, un punto de recogida de datos o una lectura constan de tres fases: 1. Excitación: el instrumento StepOne ilumina todos los pocillos de la placa de reacción en el instrumento StepOne para excitar los fluoróforos de cada reacción. 2. Emisión: la óptica del instrumento StepOne capta la fluorescencia residual que se emite desde los pocillos de la placa de reacción. La imagen resultante que capta el dispositivo sólo consta de luz que se corresponde con el rango de las longitudes de onda de emisión. 3. Recogida: el instrumento StepOne crea una representación digital de la fluorescencia residual recogida en un intervalo de tiempo fijado. El software StepOne almacena la imagen fluorescente bruta para analizarla. Después de un proceso, el software StepOne utiliza datos de calibración (espacial, espectral y de fondo) para determinar la ubicación y la intensidad de las señales fluorescentes en cada lectura, el fluorocromo asociado a cada señal fluorescente y el significado de la señal. 1-2

17 Capítulo 1 Introducción Consumibles admitidos El sistema StepOne admite los consumibles que se enumeran a continuación. Estos consumibles se utilizan en protocolos o reactivos estándar y rápidos. Consumible MicroAmp Fast Optical 48-Well Reaction Plates MicroAmp Optical 48-Well Adhesive Film MicroAmp Fast 8-Tube Strips MicroAmp Optical 8-Cap Strips Número de referencia MicroAmp Fast Reaction Tubes with Caps MicroAmp Fast 48-Well Trays MicroAmp 48-Well Base Adaptor MicroAmp Splash Free 96-Well Base G D E F A C B A C B C # Consumible A B C D E F G MicroAmp Fast Optical 48-Well Reaction Plate MicroAmp Fast 48-Well Tray MicroAmp Splash Free 96-Well Base MicroAmp Optical 8-Cap Strip MicroAmp Fast 8-Tube Strip MicroAmp Fast Reaction Tubes with Caps MicroAmp Optical 48-Well Adhesive Film Para obtener más información Para obtener más información acerca de alguno de los temas que se explican en esta guía, acceda a la ayuda desde Applied Biosystems StepOne Real-Time PCR System Software pulsando F1, haciendo clic en en la barra de herramientas o seleccionado Help (Ayuda) StepOne Help (Ayuda de StepOne). 1-3

18 Capítulo 1 Introducción Preparación de experimentos en el sistema StepOne Flujo de trabajo general Información de esta guía Antes de realizar experimentos en el sistema StepOne, prepare el experimento de la siguiente forma: 1. Seleccione un tipo de experimento (página 1-5). 2. Seleccione el tipo de reactivo (página 1-6). 3. Seleccione el tipo de ensayo (página 1-7). En este capítulo, se ofrece información general acerca de los tipos de experimentos, los tipos de reactivos y los tipos de ensayos que se pueden utilizar en el sistema StepOne. En capítulos posteriores se ofrece información específica: Capítulo Capítulo 2, Introducción a los reactivos Capítulo 3, Experimentos de cuantificación Capítulo 4, Experimentos de genotipado Capítulo 5, Experimentos de presencia/ausencia Descripción Describe y compara los reactivos TaqMan y SYBR Green. Proporciona información acerca de cómo reducir al mínimo la contaminación del DNA. Explica cómo funciona el tipo de experimento. Ofrece el flujo de trabajo específico para el tipo de experimento. Ofrece directrices de diseño para cada tipo de ensayo. 1-4

19 Capítulo 1 Introducción Selección del tipo de experimento En el sistema StepOne, se pueden realizar los siguientes tipos de experimentos: Cuantificación, incluidos: Curva estándar Curva estándar relativa C T comparativos ( C T ) Genotipado Presencia/ausencia Nota: También se puede realizar un análisis de curva de disociación en el sistema StepOne. Experimentos de punto final y experimentos en tiempo real Los tres tipos de experimentos se pueden clasificar como experimentos en tiempo real y experimentos de punto final, tal y como se explica a continuación. Categoría Propiedades Tipo de experimento Tiempo real El instrumento supervisa el progreso de la PCR a medida que se produce. Se recogen datos durante el proceso de PCR. Las reacciones se caracterizan por el punto temporal del ciclo en el que se detecta por primera vez la amplificación de una diana. Punto final Los datos se recogen al final del proceso de PCR. Las reacciones se caracterizan por la cantidad de diana acumulada al final de la PCR. El punto de datos es la intensidad normalizada del fluorocromo notificador, o R n. Nota: Algunos experimentos de punto final también incluyen puntos de datos anteriores a la PCR. Si es así, el sistema calcula el valor delta R n ( R n ) de acuerdo con la siguiente fórmula: Cuantificación Genotipado Presencia/ausencia Kwok y Higuchi, Saiki et al., R n posterior a PCR R n anterior a PCR = R n 1-5

20 Capítulo 1 Introducción Selección del tipo de reactivo En el sistema StepOne, se pueden utilizar los siguientes tipos de reactivos (químicos): Reactivos TaqMan Reactivos SYBR Green Otros reactivos basados en fluorescencia Reactivos TaqMan Los reactivos TaqMan incluyen ensayos TaqMan (mezclas preformuladas que contienen conjuntos de sondas y cebadores) y mezclas de reacción TaqMan. Los reactivos TaqMan se pueden utilizar para los siguientes tipos de experimentos: Cuantificación, incluidos: Curva estándar Curva estándar relativa C T comparativos ( C T ) Genotipado Presencia/ausencia IMPORTANTE! Applied Biosystems no recomienda el uso del fluorocromo TAMRA como notificador o apantallador con el sistema StepOne. Reactivos SYBR Green Los reactivos SYBR Green incluyen cebadores y mezclas de reacción que contienen fluorocromo SYBR Green. Los reactivos SYBR Green se pueden utilizar para los experimentos de cuantificación de: Curva estándar Curva estándar relativa C T comparativos ( C T ) Nota: No se puede realizar una PCR en multiplex con reactivos SYBR Green. Para obtener más información, consulte Selección de PCR en singleplex o en multiplex en la página Otros reactivos Se pueden utilizar otros reactivos basados en fluorescencia en el sistema StepOne, pero se debe tener en cuenta lo siguiente: El software StepOne calcula automáticamente los volúmenes de reacción de los reactivos TaqMan y SYBR Green, pero no de otros reactivos. Se debe diseñar el experimento con el flujo de trabajo Advanced Setup (Configuración avanzada), en lugar de con el flujo de trabajo del asistente de diseño. 1-6

21 Capítulo 1 Introducción Selección del tipo de ensayo En el software StepOne, se pueden seleccionar los siguientes tipos de ensayos para los experimentos de cuantificación, presencia/ ausencia y genotipado: Tipo de experimento Tipo de ensayo Véase... Cuantificación Presencia/ausencia En inventario y fabricado bajo pedido Personalizado más abajo Genotipado Prediseñado/validado Personalizado Diseñado por el usuario página 1-8 Los experimentos de cuantificación incluyen experimentos de curva estándar, cuantificación relativa. Experimentos de cuantificación y de presencia/ ausencia Ensayos en inventario/fabricados bajo pedido (Made to Order) Para los experimentos de cuantificación o de presencia/ausencia, seleccione el tipo de ensayo Inventoried/Made to Order (En inventario/fabricado bajo pedido) en el software StepOne si utiliza: TaqMan Gene Expression Assays, en inventario: conjuntos de cebadores y sondas MGB (ligando de unión al surco menor) TaqMan prediseñados con el marcaje FAM, como fluorocromo que se pueden adquirir ya preparados. La mezcla del ensayo está disponible en un solo tubo de 20 preformulado. TaqMan Gene Expression Assays, fabricados bajo pedido (Made to Order): conjuntos de cebadores y sondas TaqMan MGB prediseñados con el marcaje fam, como fluorocromo que se fabrican en el momento de realizar el pedido. La mezcla del ensayo está disponible en un solo tubo de 20 preformulado. Custom TaqMan Gene Expression Assays: conjuntos de cebadores y sondas TaqMan MGB con el marcaje del fluorocromo FAM que están diseñados, sintetizados y formulados por el servicio Custom TaqMan Genomic Assays de acuerdo con la información de secuencia remitida. La mezcla del ensayo está disponible en un solo tubo de 20 o 60 preformulado. Nota: Cuando seleccione el tipo de ensayo en el software StepOne, vaya a la pantalla Reaction Setup (Configuración de reacción) en el flujo de trabajo del asistente de diseño o Advanced Setup (Configuración avanzada) y, a continuación, seleccione Inventoried/Made to Order (En inventario/fabricado bajo pedido) en el menú desplegable Assay Type (Tipo de ensayo). 1-7

22 Capítulo 1 Introducción Ensayos personalizados (Custom Assays) Para los experimentos de cuantificación y de presencia/ausencia, seleccione el tipo de ensayo Custom (Personalizado) en el software StepOne si va a diseñar sus propios ensayos (cebadores o sondas) con el software Primer Express y reactivos TaqMan o SYBR Green. Cuando diseñe sus propios ensayos, siga las directrices de diseño de ensayos de Applied Biosystems para optimizar los resultados. IMPORTANTE! Applied Biosystems no recomienda el uso del fluorocromo TAMRA como notificador o apantallador con el sistema StepOne. Nota: Cuando seleccione el tipo de ensayo en el software StepOne, vaya a la pantalla Reaction Setup (Configuración de reacción) en el flujo de trabajo del asistente de diseño o Advanced Setup (Configuración avanzada) y, a continuación, seleccione Custom (Personalizado) en el menú desplegable Assay Type (Tipo de ensayo). Experimentos de genotipado Ensayos prediseñados/validados En los experimentos de genotipado, el tipo de ensayo Pre-Designed/Validated (Prediseñado/validado) incluye: TaqMan SNP Genotyping Assays: conjuntos de cebadores y sondas MGB (ligando de unión al surco menor) TaqMan prediseñados con el marcaje de los fluorocromos FAM y VIC que están disponibles en dos categorías: TaqMan Validated & Coding SNP Genotyping Assays, que se pueden adquirir ya preparados (en inventario). La mezcla del ensayo está disponible en un solo tubo de 20 preformulado. TaqMan Pre-Designed SNP Genotyping Assays, que se fabrican en el momento de realizar el pedido (fabricados bajo pedido [Made to Order]). La mezcla del ensayo está disponible en un solo tubo de 20 preformulado. TaqMan Drug Metabolism Genotyping Assays: conjuntos de cebadores y sondas TaqMan MGB prediseñados con el marcaje de los fluorocromos FAM y VIC que se pueden adquirir ya preparados (en inventario). La mezcla del ensayo está disponible en un solo tubo de 20 preformulado. Pre-Developed TaqMan Assay Reagents for Allelic Discrimination (TaqMan PDARs for AD): conjuntos de cebadores y sondas TaqMan MGB prediseñados con el marcaje de los fluorocromos FAM y VIC que se pueden adquirir ya preparados (en inventario). La mezcla del ensayo está disponible en un solo tubo de 10 preformulado. Nota: Cuando seleccione un ensayo de SNP en el software StepOne, vaya a la pantalla SNP Assays (Ensayos de SNP) del flujo de trabajo del asistente de diseño o a la pantalla Plate Setup (Configuración de placa) del flujo de trabajo Advanced Setup (Configuración avanzada). En la pantalla SNP Assays (Ensayos de SNP) o Plate Setup (Configuración de placa), se puede seleccionar un ensayo en la biblioteca o crear uno nuevo. 1-8

23 Capítulo 1 Introducción Ensayos personalizados (Custom Assays) Para los experimentos de genotipado, el tipo de ensayo Custom (Personalizado) incluye Custom TaqMan SNP Genotyping Assays. Custom TaqMan SNP Genotyping Assays son conjuntos de cebadores y sondas TaqMan MGB con el marcaje de los fluorocromos FAM y VIC que están diseñados, sintetizados y formulados por el servicio Custom TaqMan Genomic Assays de acuerdo con la información de secuencia remitida. La mezcla del ensayo está disponible en un solo tubo de 40 o 80 preformulado. Nota: Cuando seleccione un ensayo de SNP en el software StepOne, vaya a la pantalla SNP Assays (Ensayos de SNP) del flujo de trabajo del asistente de diseño o a la pantalla Plate Setup (Configuración de placa) del flujo de trabajo Advanced Setup (Configuración avanzada). En la pantalla SNP Assays (Ensayos de SNP) o Plate Setup (Configuración de placa), se puede seleccionar un ensayo en la biblioteca o crear uno nuevo. Ensayos diseñados por el usuario Si desea diseñar sus propios cebadores y sondas para los ensayos de SNP, consulte Primer Express Software Version 3.0 Getting Started Guide. IMPORTANTE! Applied Biosystems no recomienda el uso del fluorocromo TAMRA como notificador o apantallador con el sistema StepOne. 1-9

24 Capítulo 1 Introducción 1-10

25 Introducción a los reactivos 2 2 Este capítulo cubre los siguientes temas: Introducción Reactivos TaqMan Reactivos SYBR Green Selección del tipo de reactivo apropiado Reducción al mínimo de los contaminantes del DNA

26 Capítulo 2 Introducción a los reactivos Introducción Applied Biosystems ha desarrollado dos tipos de reactivos (químicos) que se pueden utilizar para detectar productos de PCR en Applied Biosystems StepOne Real-Time PCR System: Reactivos TaqMan (más abajo) Reactivos SYBR Green (página 2-4) Reactivos TaqMan Tipos de experimentos Desarrollo de reactivos TaqMan Funcionamiento de los reactivos TaqMan Los reactivos TaqMan incluyen ensayos TaqMan (mezclas preformuladas que contienen conjuntos de sondas y cebadores) y mezclas de reacción TaqMan. Los ensayos son específicos de la diana de interés. Las mezclas de reacción contienen los demás componentes que son necesarios para la reacción de PCR. Los reactivos TaqMan se pueden utilizar para los siguientes tipos de experimentos: Cuantificación, incluidos: Curva estándar Curva estándar relativa C T comparativos ( C T ) Genotipado Presencia/ausencia IMPORTANTE! Applied Biosystems no recomienda el uso del fluorocromo TAMRA como notificador o apantallador con el sistema StepOne. Al principio, se utilizaban fluorocromos intercalantes para medir los productos de PCR en tiempo real. El principal inconveniente de este método de detección es que detecta la acumulación de productos de PCR tanto específicos como no específicos. Los sistemas en tiempo real para PCR mejoraron gracias a la introducción de sondas con marcajes de fluorocromos que utilizan la actividad 5 nucleasa de la Taq polimerasa de DNA. La existencia de estas sondas fluorogénicas permitió desarrollar un método en tiempo real para detectar únicamente productos de amplificación específicos. Los reactivos TaqMan utilizan una sonda fluorogénica para detectar un producto de PCR específico a medida que se acumula durante la PCR. Así es cómo funciona: 1. Se construye una sonda oligonucleótida con un fluorocromo notificador unido al extremo 5 y un apantallador en el extremo 3. Mientras la sonda está intacta, la proximidad del apantallador reduce enormemente la fluorescencia que emite el fluorocromo notificador por medio de la transferencia de energía de resonancia de fluorescencia (FRET; resonancia de Förster, Förster, V. T. 1948) a través del espacio. 2. Si la diana está presente, la sonda anilla entre las localizaciones de los cebadores y se rompe por la actividad de la 5' nucleasa de la Taq Polimerasa, durante la extensión. 2-2

27 Capítulo 2 Introducción a los reactivos 3. Esta ruptura de la sonda: Separa el fluorocromo notificador del apantallador, lo que aumenta la señal del fluorocromo notificador. Quita la sonda de la cadena de la diana, lo que permite que la extensión del cebador continúe hasta el final de la cadena del molde. De esta forma, la inclusión de la sonda no inhibe el proceso global de PCR. 4. En cada ciclo, se separan más moléculas de fluorocromo notificador de sus respectivas sondas, lo que produce un aumento de la intensidad de la fluorescencia que es proporcional a la cantidad de amplicón producido. Cuanto más alto sea el número inicial de copias de la diana de ácido nucleico, antes se observará un aumento significativo de la fluorescencia. La Figura 2-1 ilustra este proceso. POLIMERIZACIÓN DESPLAZAMIENTO DE CADENA PARTICIÓN POLIMERIZACIÓN COMPLETADA CEBADOR DIRECTO 5' 3' R SONDA R = NOTIFICADOR Q Q = APANTALLADOR 3' 5' 5' 3' R Q 3' 5' 5' 3' R Q 3' 5' 5' 3' R Q 3' 5' 5' 3' 5' CEBADOR REVERSO 5' 3' 5' 5' 3' 5' 5' 3' 5' Paso 1: un notificador (R) y un apantallador (Q) se unen a los extremos 5 y 3 de una sonda TaqMan. Paso 2: cuando ambos marcajes están unidos a la sonda, se inhibe la emisión del fluorocromo notificador. Paso 3: durante cada ciclo de extensión, la polimerasa Taq DNA separa el fluorocromo notificador de la sonda. Paso 4: una vez separado del apantallador, el fluorocromo notificador emite su fluorescencia característica. Figura 2-1 Funcionamiento de los reactivos TaqMan Sondas TaqMan MGB Applied Biosystems recomienda el uso general de sondas TaqMan MGB, sobre todo si las sondas TaqMan convencionales superan los 30 nucleótidos. Las sondas TaqMan MGB contienen: Un fluorocromo notificador en el extremo 5 : genera una señal cuando se rompe a causa de la actividad 5 nucleasa de la Taq polimerasa de DNA. Un apantallador no fluorescente (NFQ) en el extremo 3 : permite a los sistemas de PCR en tiempo real medir con más precisión las contribuciones de fluorocromo notificador, dado que el apantallador no emite fluorescencia. Un ligando de unión al surco menor (MGB) en el extremo 3 : aumenta la temperatura de desnaturalización (Tm) de las sondas sin aumentar la longitud de la sonda (Afonina et al., 1997; Kutyavin et al., 1997), por lo que permite diseñar sondas más cortas. Por consiguiente, las sondas TaqMan MGB tienen mayores diferencias en los valores de Tm entre sondas complementarias y no perfectamente complementarias con la diana. Estas mayores diferencias en los valores de Tm permiten realizar el genotipado con precisión. 2-3

28 Capítulo 2 Introducción a los reactivos Applied Biosystems ofrece las siguientes sondas TaqMan MGB con NFQ para el sistema StepOne : Fluorocromo con marcaje en 5 Fluorocromo con marcaje en 3 Otras funciones Ensayos TaqMan (sonda TaqMan MGB ) Ensayos TaqMan personalizados (sonda TaqMan MGB ) Sondas personalizadas Sonda TaqMan MGB personalizada Expresión de genes Fluorocromo FAM NFQ MGB Genotipado SNP Fluorocromos FAM y VIC NFQ MGB Expresión de genes Fluorocromo FAM NFQ MGB Genotipado SNP Fluorocromos FAM y VIC NFQ MGB Fluorocromo FAM, TET, NFQ MGB NED o VIC IMPORTANTE! Applied Biosystems no recomienda el uso del fluorocromo TAMRA como notificador o apantallador con el sistema StepOne. Reactivos SYBR Green Tipos de experimentos Desarrollo de reactivos SYBR Green Los reactivos SYBR Green incluyen cebadores y mezclas de reacción que contienen fluorocromo SYBR Green. Los reactivos SYBR Green se pueden utilizar para los experimentos de cuantificación de: Curva estándar Curva estándar relativa C T comparativos ( C T ) Nota: No se puede realizar una PCR en multiplex con reactivos SYBR Green. Para obtener más información, consulte Selección de PCR en singleplex o en multiplex en la página Las pequeñas moléculas que se unen al DNA de doble cadena se pueden dividir en dos clases: las que se intercalan en el DNA y las que se unen al surco menor del DNA. Higuchi (Higuchi et al., 1992) utilizaba el agente intercalante bromuro de etidio para la detección de la PCR en tiempo real. Hoechst es un ejemplo de un fluorocromo de ligando de unión al surco menor cuya fluorescencia aumenta cuando se une a DNA de doble cadena (Higuchi et al., 1993). Con independencia del método de unión, al menos hay dos requisitos para que un fluorocromo de unión a DNA detecte productos de PCR en tiempo real: Aumento de fluorescencia cuando se une a DNA de doble cadena Sin inhibición de la PCR Applied Biosystems ha desarrollado condiciones que permiten el uso del fluorocromo SYBR Green I en la PCR sin que haya inhibición de la PCR y con mayor sensibilidad de detección en comparación con el bromuro de etidio. 2-4

29 Capítulo 2 Introducción a los reactivos Funcionamiento de los reactivos SYBR Green Los reactivos SYBR Green utilizan el fluorocromo SYBR Green I para detectar productos de PCR uniéndose al DNA de doble cadena que se forma durante la PCR. Así es cómo funciona: 1. Cuando se añade SYBR Green PCR Master Mix a la muestra, el fluorocromo SYBR Green I se une inmediatamente a todo el DNA de doble cadena. 2. Durante la PCR, AmpliTaq Gold DNA Polymerase amplifica la diana, lo que crea el producto de PCR, o amplicón. 3. A continuación, el fluorocromo SYBR Green I se une a cada copia nueva del DNA de doble cadena. 4. A medida que se produce la PCR, se crea más amplicón. Dado que el fluorocromo SYBR Green I se une a todo el DNA de doble cadena, el resultado es un aumento de la intensidad de la fluorescencia que es proporcional a la cantidad de producto de PCR de doble cadena producido. Las Figuras 2-2 más abajo ilustran este proceso. CEBADOR DIRECTO CEBADOR REVERSO Paso 1: Configuración de la reacción El fluorocromo SYBR Green I emite una fluorescencia cuando se une a DNA de doble cadena. Paso 2: Desnaturalización Cuando el DNA se desnaturaliza, se libera el fluorocromo SYBR Green I y la fluorescencia disminuye considerablemente. Paso 3: Polimerización Durante la extensión, los cebadores se hibridan y se genera el producto de PCR. Paso 4: Polimerización completada El fluorocromo SYBR Green I se une al producto de doble cadena, lo que produce un aumento neto de la fluorescencia que detecta el instrumento. Figura 2-2 Funcionamiento de los reactivos SYBR Green Selección del tipo de reactivo apropiado Los reactivos TaqMan y SYBR Green se pueden utilizar para los tipos de experimentos que se indican a continuación. Tipo de reactivo Cuantificación (Capítulo 3) Tipo de experimento Genotipado (Capítulo 4) Incluye experimentos de curva estándar, cuantificación relativa. Presencia/ ausencia (Capítulo 5) Reactivos SYBR Green Sí No recomendado No recomendado Reactivos TaqMan Sí Sí Sí 2-5

30 Capítulo 2 Introducción a los reactivos Consideraciones sobre los experimentos de cuantificación Los experimentos de cuantificación se pueden realizar con reactivos TaqMan o SYBR Green. Tenga en cuenta lo siguiente a la hora de elegir entre dos tipos de reactivos: Tipo de reactivo Reactivos o kits TaqMan Proceso PCR y detección de cdna a. Componentes del ensayo Descripción MGB Cebador reverso Sonda Los reactivos TaqMan utilizan una sonda fluorogénica para permitir la detección de un producto de PCR específico cuando se acumula durante los ciclos de PCR. Ventajas F Cebador directo 3' Q 5' Molde de cdna cdna 3' 5' Leyenda b. Plantilla desnaturalizada e hibridada de los componentes del ensayo Aumenta la especificidad con una sonda. La hibridación específica entre la sonda y la diana genera una señal de fluorescencia. Proporciona capacidades de multiplex. Hay disponibles ensayos preformulados que están optimizados para funcionar en condiciones de ciclos térmicos universales. Se puede utilizar para la RT-PCR de 1 o 2 pasos. 3' 5' Cebador reverso MGB Sonda F RP Fluorocromo FAM Q Apantallador Q Cebador directo 3' 5' Cebador aleatorio F MGB c. Generación de señal Ligando de unión al surco menor AmpliTaq Gold DNA Polymerase 3' 5' Sonda Cebador reverso Cebador F Cebador directo MGB 5' Q 3' 3' 5' Molde Cebador extendido Limitaciones Requiere la síntesis de una única sonda Reactivos SYBR Green Paso 1: Configuración de la reacción El fluorocromo SYBR Green I emite una fluorescencia cuando se une a DNA de doble cadena. Descripción Los reactivos SYBR Green utilizan el fluorocromo SYBR Green I, que es un fluorocromo de unión a DNA de doble cadena que sirve para detectar productos de PCR cuando se acumulan durante los ciclos de PCR. Paso 2: Desnaturalización Cuando el DNA se desnaturaliza, se libera el fluorocromo SYBR Green I y la fluorescencia disminuye considerablemente. Ventajas Económico (no se necesita una sonda). Permite que los análisis de curvas de disociación midan la Tm de todos los productos de PCR. Se puede utilizar para la RT-PCR de 1 o 2 pasos. Limitaciones Se une de manera no específica a todas las secuencias de DNA de doble cadena. Para evitar señales positivas falsas, compruebe la formación de un producto no específico utilizando un análisis de gel o de curva de disociación. CEBADOR DIRECTO Paso 3: Polimerización Durante la extensión, los cebadores se hibridan y se genera el producto de PCR. CEBADOR REVERSO Paso 4: Polimerización completada El fluorocromo SYBR Green I se une al producto de doble cadena, lo que produce un aumento neto de la fluorescencia que detecta el instrumento. IMPORTANTE! Applied Biosystems no recomienda el uso del fluorocromo TAMRA como notificador o apantallador con el sistema StepOne. 2-6

31 Capítulo 2 Introducción a los reactivos Reducción al mínimo de los contaminantes del DNA La capacidad de amplificación de DNA del proceso de PCR hace necesario el uso de prácticas especiales de laboratorio para realizar experimentos en los que se utilizan reactivos TaqMan o SYBR Green. Las muestras que tienen altas concentraciones de DNA podrían introducir contaminación, ya sea por los controles de moldes de DNA o por la contaminación por arrastre de PCR. Asimismo, debido a la naturaleza no específica del fluorocromo SYBR Green I, se detecta cualquier DNA de doble cadena. Cuando utilice reactivos SYBR Green, compruebe si se forman productos no específicos mediante un análisis de curva de disociación o de gel. Procure evitar la contaminación con el DNA diana. Los ensayos de expresión de genes que abarcan uniones exón-exón minimizan el efecto de los contaminantes de gdna (DNA genómico). Uso de UNG para reducir al mínimo la reamplificación de los productos de contaminación por arrastre La uracil-n-glicosilasa, Amperase (UNG) es una enzima recombinante de 26-kDa codificada por el gen de uracil-n-glicosilasa de Escherichia coli. Este gen se ha introducido en un huésped de E. coli para dirigir la expresión de la forma nativa de la enzima (Kwok y Higuchi, 1989). La UNG actúa en DNA de cadena sencilla y de doble cadena que contiene du. Hidroliza las uniones uracil-glicosídicas en emplazamientos de DNA que contienen du. La enzima causa la liberación de uracilo, por lo que se crea un emplazamiento apiridímico sensible al álcali en el DNA. La enzima no tiene ninguna actividad en el RNA o en el DNA que contiene dt (Longo et al., 1990). Ensayos TaqMan Para los ensayos TaqMan, el tratamiento de AmpErase UNG puede evitar la reamplificación de los productos de PCR de contaminación por arrastre a partir de reacciones de PCR anteriores. Si dutp sustituye a dttp en la reacción de amplificación, el tratamiento de AmpErase UNG puede eliminar hasta copias de amplicón por reacción de 50µL. Nota: TaqMan 2 Universal PCR Master Mix está disponible con o sin AmpErase UNG. Si utiliza TaqMan Fast Universal PCR Master Mix (2 ), No AmpErase UNG, debe adquirir AmpErase UNG por separado. Ensayos de fluorocromo SYBR Green I Para los ensayos de fluorocromo SYBR Green I, el tratamiento de AmpErase UNG puede evitar la reamplificación de los productos de PCR de contaminación por arrastre a partir de reacciones de PCR anteriores. Aunque Power SYBR Green PCR Master Mix y SYBR Green PCR Master Mix no contienen AmpErase UNG, sí contienen dutp y, por lo tanto, son compatibles con AmpErase UNG. Si se sospecha que hay contaminación por arrastre de PCR, utilice AmpErase UNG para solucionar el problema. Nota: AmpErase UNG se puede adquirir de manera individual o como parte de SYBR Green PCR Core Reagents Kit. 2-7

32 Capítulo 2 Introducción a los reactivos Prácticas generales de PCR Utilice las siguientes precauciones para reducir al mínimo la contaminación de las muestras y la contaminación por arrastre de productos de PCR: Lleve una bata de laboratorio limpia (que no llevara puesta mientras manejaba productos de PCR amplificados o durante la preparación de las muestras) y guantes limpios cuando prepare las muestras para la reacción de amplificación. Cámbiese de guantes siempre que sospeche que están contaminados. Mantenga áreas separadas, equipo especial y suministros para: Preparación de las muestras. Configuración de la PCR. Nunca lleve productos de PCR amplificados al área de configuración de la PCR. Amplificación de PCR. Análisis de productos de PCR. Abra y cierre todos los tubos de muestras con cuidado. Procure no pulverizar ni salpicar con muestras de PCR. Utilice pipetas de desplazamiento de aire o desplazamiento positivo con puntas con filtro. Cambie las puntas después de cada uso. Mantenga las reacciones y los componentes tapados todo el tiempo posible. Limpie las mesas del laboratorio y el equipo periódicamente con una solución de lejía al 10% o 70% de etanol. 2-8

33 Experimentos de cuantificación 3 3 Este capítulo cubre los siguientes temas: Sección 3.1 Acerca de los experimentos de cuantificación Sección 3.2 Directrices de diseño

34 Capítulo 3 Experimentos de cuantificación 3-2

35 Capítulo 3 Experimentos de cuantificación Sección 3.1 Acerca de los experimentos de cuantificación Esta sección cubre los siguientes temas: Introducción Selección de un método de cuantificación Selección de una RT-PCR de 1 o 2 pasos Selección de PCR en singleplex o en multiplex Selección del tipo de reactivo Selección del tipo de ensayo

36 Capítulo 3 Experimentos de cuantificación Introducción Qué es un experimento de cuantificación? Funcionamiento de los experimentos de cuantificación Flujo de trabajo Un experimento de cuantificación es un experimento en tiempo real en el que se mide la cantidad de una secuencia de ácido nucleico de una diana (diana) durante cada ciclo de amplificación de la reacción en cadena de polimerasa (PCR). La diana puede ser DNA, cdna o RNA. En esta guía, se explican tres tipos de experimentos de cuantificación: Curva estándar (página 3-5) Curva estándar relativa (página 3-5) C T comparativos ( C T ) (página 3-6) En los experimentos de cuantificación en tiempo real, las reacciones se caracterizan por el punto temporal del ciclo en el que la amplificación de un producto de PCR logra un nivel fijo de fluorescencia, en lugar de la cantidad final de producto de PCR acumulado después de un número de ciclos fijo. Las gráficas de amplificación muestran la fluorescencia detectada en el número de ciclos que se han realizado. En los primeros ciclos de la PCR, no hay ningún cambio significativo en la señal de fluorescencia. Este rango predefinido de ciclos de PCR se denomina línea basal. En primer lugar, el software genera una gráfica de amplificación en la que se ha sustraído la línea basal. Para ello, calcula una tendencia matemática de la señal del notificador fluorescente normalizado (valores Rn correspondientes a los ciclos de la línea basal). A continuación, un algoritmo busca el punto de la gráfica de amplificación en el que la señal del notificador fluorescente normalizado con la línea basal corregida (valor delta Rn [ Rn]) cruza el umbral. El ciclo fraccional en el que el valor Rn cruza el umbral se define como C T. Antes de realizar experimentos de cuantificación en Applied Biosystems StepOne Real-Time PCR System, prepare el experimento de la siguiente forma: 1. Seleccione un método de cuantificación (página 3-5). 2. Seleccione una RT-PCR de 1 o 2 pasos (página 3-8) 3. Seleccione reacciones de PCR en singleplex o en multiplex (página 3-10). 4. Seleccione el tipo de reactivo (página 3-13). 5. Seleccione el tipo de ensayo (página 3-13). 6. Revise las directrices de diseño del tipo de ensayo que ha seleccionado (Sección 3.2 en la página 3-17). 3-4

37 Capítulo 3 Experimentos de cuantificación Selección de un método de cuantificación Acerca de los experimentos de curva estándar Los experimentos de curva estándar determinan la cantidad absoluta de una diana en una muestra. Para conseguir los resultados, se utiliza una curva estándar construida a partir de una dilución seriada de una cantidad conocida. Componentes Las reacciones de PCR de los experimentos de curva estándar incluyen los siguientes componentes: Muestra: la muestra en la que la cantidad de la diana es desconocida. Estándar: una muestra de una cantidad conocida. Dilución seriada de estándar: un conjunto de diluciones del estándar (por ejemplo, 1:2, 1:4, 1:8, 1:16, 1:32) que se utilizan para construir una curva estándar. Réplicas: reacciones idénticas que contienen componentes y volúmenes idénticos. Controles negativos: muestras que contienen agua o tampón en lugar de molde; también se denominan NTC (sin ácido nucleico molde). Los controles negativos no se deberían amplificar. Acerca de los experimentos de curva estándar relativa Los experimentos de curva estándar relativa determinan el cambio de expresión de una diana en una muestra en relación con la misma diana de una muestra de referencia. Para conseguir los resultados, se utiliza una curva estándar construida a partir de una dilución seriada de una cantidad conocida. Los experimentos de curva estándar relativa se suelen utilizar para: Comparar niveles de expresión de un gen en diferentes tejidos. Comparar los niveles de expresión de un gen en una muestra tratada y en una muestra no tratada. Comparar los niveles de expresión de alelos de tipo salvaje y alelos mutados. Componentes Las reacciones de PCR de los experimentos de curva estándar relativa incluyen los siguientes componentes: Muestra: la muestra en la que la cantidad de la diana es desconocida. Muestra de referencia: la muestra utilizada como base para los resultados de la comparación. Por ejemplo, en un estudio sobre los efectos de las drogas en la expresión de genes, un control no tratado sería una muestra de referencia apropiada. Estándar: una muestra de una cantidad conocida. Dilución seriada de estándar: un conjunto de diluciones del estándar (por ejemplo, 1:2, 1:4, 1:8, 1:16, 1:32) que se utilizan para construir una curva estándar. En todas las muestras, la cantidad de diana se determina realizando una interpolación a partir de la curva estándar y luego dividiendo por la cantidad de diana de la muestra de referencia. Dado que la muestra de referencia es la 3-5