TaqMan GMO Screening Kit. Part No:

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1 TaqMan GMO Screening Kit Part No:

2 1. Introducción Los organismos modificados genéticamente (OMG) se encuentran ampliamente distribuidos, siendo la soja y el maíz los vegetales que ocupan mayor extensión de cultivo a nivel mundial. Estas especies y sus derivados (almidón de maíz, proteína de soja, etc.) constituyen los ingredientes de más del 60% de los alimentos que consumimos. La Unión Europea ha establecido un marco legal que regula el empleo, la liberación al medio ambiente y sobre todo, el etiquetado de los productos alimenticios que contienen estos organismos. El TaqMan GMO Screening kit, permite analizar la presencia de ADN transgénico mediante la detección de tres regiones reguladoras presentes en los organismos modificados genéticamente aprobados por la UE. Este kit emplea tecnología Real-Time PCR y contiene todos los reactivos necesarios para llevar a cabo la detección de OMG en ADN obtenido a partir de cualquier alimento o pienso. Además, el kit contiene un Control Positivo Interno (IPC) que permite identificar la presencia de inhibición durante el proceso de PCR. Rev /12

3 2. Descripción del kit El TaqMan GMO Screening kit permite detectar todos los eventos transgénicos aprobados en la Unión Europea, así como la mayoría de los eventos descritos en las bases de datos mundiales. El promotor 35S obtenido a partir del virus de mosaico de la coliflor (CaMV) y el terminador NOS procedente de Agrobacterium tumefaciens, son los elementos reguladores que se han analizado tradicionalmente para el cribado de material transgénico en alimentos. Actualmente, estos elementos reguladores no cubren eventos transgénicos tan importantes como la soja MON89788, la remolacha H7-1 o la colza GT73. Con el objetivo de disponer del mayor espectro de detección, el TaqMan GMO Screening kit, incluye el promotor 34S del Figwort Mosaic Virus (FMV), además de las regiones reguladoras P35S y TNOS Los elementos reguladores presentes en los OMG se encuentran de forma natural en los organismos de los que proceden (CaMV, A. tumefaciens y FMV). Por este motivo, el empleo de regiones reguladoras suscita controversia a la hora de interpretar un resultado positivo. TaqMan GMO Screening kit, incorpora la detección simultanea de una región genómica exclusiva de estos tres organismos que permite discriminar de forma inequívoca si un resultado positivo se debe a la presencia de material modificado genéticamente o se debe a la presencia natural de estos organismos. Para llevar a cabo el análisis de cada muestra, se realizan cuatro reacciones de PCR a tiempo real. En cada una de estas reacciones se amplifican dos regiones independientes mediante una única reacción de PCR multiplex, empleando dos canales del termociclador (FAM y VIC). A continuación se describen las reacciones de amplificación: P35S/CaMV: En esta reacción hay dos sondas tipo TaqMan una esta marcada con el fluoróforo FAM y detecta amplificados del elemento regulador P35S del virus CaMV y la otra sonda esta marcada con VIC para detectar un amplificado espécifico del virus CaMV. TNOS/A. tumefaciens: La reacción incluye dos sondas TaqMan. Una de ellas está marcada con el fluoróforo FAM y detecta amplificados del elemento regulador TNOS procedente de A. tumefacines. La otra sonda esta marcada con VIC y detecta amplificados procedentes de una región genómica exclusiva de esta bacteria. Rev /12

4 P34S/FMV: La reacción incluye dos sondas TaqMan. Una de ellas está marcada con el fluoróforo FAM y detecta amplificados del elemento regulador P34S procedente del virus FMV. La otra sonda esta marcada con VIC y detecta amplificados procedentes de una región genómica exclusiva de este virus. Vegetal/IPC: La reacción incluye dos sondas TaqMan. Una de ellas está marcada con el fluoróforo FAM y detecta ADN vegetal. La otra sonda esta marcada con VIC y detecta un Control Positivo Interno, que utilizaremos para descartar la presencia de inhibidores en la muestra. Se ha verificado que el límite de detección de la PCR es de 5 copias de ADN por reacción para todas las regiones analizadas con este kit. Este kit permite detectar estándares certificados que contengan un porcentaje igual o inferior al 0,1% de diferentes eventos y especies vegetales transgénicas. 3. Componentes y almacenamiento del kit Este kit contiene los reactivos necesarios para la realización de 48 determinaciones de cada una de las regiones analizadas (ver apartado anterior): REACTIVOS Identificación Cantidad Conservación P35S Disco rojo 400 μl -20ºC TNOS Disco azul 400 μl -20ºC P34S-FMV Disco amarillo 400 μl -20ºC Vegetal Disco verde 400 μl -20ºC General Disco blanco 3 x 880 μl 4ºC Control Positivo Tapón naranja 100 μl -20ºC Rev /12

5 4. Listado de equipamiento necesario La siguiente tabla muestra el equipamiento necesario para utilizar el TaqMan GMO Screening Kit: EQUIPAMIENTO NECESARIO 1 Termociclador Real-time PCR con canales de detección para los fluoróforos FAM (520 nm) y VIC (550 nm) 2 Juego de micropipetas (10, 20 y 200 ul) 3 Centrífuga de sobremesa con adaptadores para placas de 96 y/o tubos 4 Vortex 5. Listado de material fungible necesario La siguiente tabla muestra el material fungible necesario para utilizar el TaqMan GMO Screening Kit: MATERIALES 1 2 Placas de PCR ópticas aptas para el termociclador empleado o tubos ópticos de 0,2 ml Films ópticos para cubrir las placas de PCR o tapas ópticas para los tubos empleados 3 Puntas con filtro desechables para micropipetas 4 Tubos estériles de 1,5 ml 5 Guantes de látex sin talco Rev /12

6 6. Preparación de las reacciones de amplificación El TaqMan GMO Screening kit está diseñado para realizar cuatro reacciones por cada muestra que se desea analizar (P35S, TNOS, P34S-FMV y Vegetal). Para estimar la cantidad de reactivos necesaria, se debe tener en cuenta el número de muestras y controles a analizar simultáneamente. Recomendamos realizar los cálculos, considerando una reacción más, o bien, incrementando un 10% el volumen de cada reactivo. Se prepararán 4 masters de PCR distintos; uno para cada región analizada. A continuación se muestra el protocolo recomendado para la preparación de las reacciones de amplificación: 1. Descongelar los (consultar página 5), el Control Positivo y los ADNs de las muestras (en caso de que se conserven congelados). 2. Dar un vórtex a cada uno de los reactivos y mantener en frío. 3. En un tubo de 1,5 ml, añadir 7,5 μl del por cada una de las reacciones. 4. Añadir 12,5 μl del General a cada una de las reacciones. Dar un vórtex y pipetear 20 μl en cada pocillo o tubo. 5. Añadir 5 μl del ADN (10-25 ng/μl) de las muestras en los pocillos correspondientes. 6. Añadir 5 μl del Control Positivo y de los controles negativos en los pocillos correspondientes. 7. Tapar la placa con film óptico y dar un spin. Rev /12

7 7. Programa de amplificación Someter las reacciones de amplificación al siguiente programa de amplificación: Temperatura Tiempo Ciclos 95ºC 10 minutos 1 95ºC 15 segundos 60ºC 1 minuto 50 Nota: Este programa ha sido validado en un equipo StepOne Real-Time PCR System de Applied Biosystems. Si se emplea en otra marca o modelo de termociclador, es posible que se deba ajustar el programa de amplificación. Póngase en contacto con nuestro servicio técnico si necesita recibir asesoramiento. Rev /12

8 8. Análisis de los resultados Antes de analizar los resultados de las muestras, se debe comprobar que el resultado obtenido en los diferentes controles es el esperado: Control Positivo: El resultado debe ser siempre positivo en todas las reacciones de amplificación, tanto en el canal de FAM como en de VIC. Controles negativos: Únicamente se debe detectar amplificación en el canal de VIC de la reacción realizada con el Vegetal. En este canal se detecta un control interno positivo (IPC) que determina la ausencia de inhibición en la muestra. Vegetal/IPC Se deberá comprobar en todas las muestras que el IPC (VIC) es positivo, y que el Ct en el que se detecta es similar al del Control Positivo. Un resultado negativo en el IPC indica la presencia de inhibidores en la muestra. Se debe tener en cuenta que es posible que el resultado del IPC sea negativo en muestras donde se detecta en una gran cantidad de ADN vegetal (FAM), debido a que los reactivos de la PCR se agotan antes de iniciarse la amplificación del IPC. P35S/CaMV La amplificación de P35S (FAM) junto con la ausencia de amplificación del CaMV (VIC) indica la presencia de material transgénico en la muestra. Si se detecta amplificación tanto para P35S como para CaMV indica que en la muestra esta presente el virus CaMV y, en este caso, no se puede determinar si la muestra contiene material transgénico ya que no es posible discriminar si el promotor 35S procede del CaMV, presente de forma natural en la muestra, o bien, procede del material modificado genéticamente. TNOS/A. tumefaciens La amplificación de TNOS (FAM) junto con la ausencia de amplificación de A. tumefaciens (VIC) indica la presencia de material transgénico en la muestra. Si se detecta amplificación tanto para TNOS como para A. tumefaciens indica que en la muestra esta presente bacteria Agrobacterium tumefaciens y, en este caso, no se puede determinar si la muestra contiene material transgénico ya que no es posible discriminar si el terminador NOS procede de la bacteria, presente de forma natural en la muestra, o bien, procede del material modificado genéticamente. Rev /12

9 P34S/FMV La amplificación de P34S (FAM) junto con la ausencia de amplificación del virus FMV (VIC) indica la presencia de material transgénico en la muestra. Si se detecta amplificación tanto para P34S como para FMV indica que en la muestra está presente el virus y, en este caso, no se puede determinar si la muestra contiene material transgénico ya que no es posible discriminar si P34S procede del virus, presente de forma natural en la muestra, o bien, procede del material modificado genéticamente. En las muestras donde no hay amplificación en las reacciones de P35S, TNOS y P34S (FMV) se puede concluir que no se ha detectado la presencia de material transgénico. En la siguiente tabla se representan gráficamente los resultados que se pueden obtener a partir del análisis de una muestra, así como la interpretación que se debe hacer a partir del resultado obtenido: Vegetal P35S TNOS P34S-FMV Veg. IPC P35S CaMV TNOS A. tum P34S FMV INTERPRETACIÓN No se ha detectado material transgénico. Se ha detectado material transgénico que contiene P35S Se ha detectado material transgénico que contiene TNOS Se ha detectado material transgénico que contiene P34S Se ha detectado la presencia de CaMV Se ha detectado la presencia de A. tumefaciens Se ha detectado la presencia de FMV Presencia de inhibidores de la PCR en la muestra * Muestra sin ADN vegetal Muestra con una gran cantidad de ADN vegetal * Si se detecta la presencia de inhibidores en la muestra, le aconsejamos que verifique si se ha puesto un exceso de ADN en la reacción (la cantidad máxima aconsejable es de 250 ng). Si la cantidad de ADN es correcta, le aconsejamos repetir la extracción del ADN empleando un nuevo protocolo (contacte con nuestro departamento técnico si precisa asesoramiento). Rev /12

10 En la siguiente tabla se representan gráficamente los resultados que se pueden obtener a partir del análisis de diferentes controles del ensayo, así como la interpretación que se debe hacer a partir del resultado obtenido: Vegetal P35S TNOS P34S-FMV Veg IPC P35S CaMV TNOS A. tum P34S FMV Control Positivo INTERPRETACIÓN Resultado esperado Control Negativo de Extracción 1 Fallo en la amplificación Resultado esperado /- - +/- - +/- - Control Negativo de PCR 2 Contaminación de la extracción con material vegetal 3 Contaminación con material transgénico Resultado esperado /- - +/- - +/ Recomendaciones: 4 Contaminación de la extracción con ADN vegetal 5 Contaminación con ADN de material transgénico 6 Contaminación, posiblemente con el Control Positivo 1 Revise el programa de amplificación y la configuración de la captura de fluorescencia. El fallo en la amplificación puede deberse a un problema técnico de configuración. 2-3 La contaminación puede deberse a algún error cometido en el proceso de manipulación de las muestras, contaminación de los reactivos o contaminación ambiental. Revise el protocolo de extracción de ADN, limpie a fondo el laboratorio donde se lleva a cabo el proceso de extracción de ADN y extreme las precauciones para evitar cualquier contaminación durante el proceso de homogeneización de las muestras. Si lo considera necesario, utilice nuevas alícuotas de los reactivos empleados en la extracción de ADN. 4-5 La contaminación de las reacciones de PCR puede a algún error cometido en el proceso de manipulación de las muestras, contaminación de los reactivos empleados o contaminación ambiental. Limpie a fondo el laboratorio donde se lleva a cabo el proceso de PCR y sus equipos. Si lo considera necesario, utilice nuevas alícuotas de los reactivos empleados en la PCR. 6 Prepare la reacción de PCR que contiene el Control Positivo en último lugar para evitar contaminaciones cruzadas. Limpie a fondo el laboratorio donde se lleva a cabo el proceso de PCR y sus equipos. Si lo considera necesario, utilice nuevas alícuotas de los reactivos empleados en la PCR. Rev /12

11 9. Control de calidad Todos los productos comercializados por el Instituto de Medicina Genómica son sometidos a un riguroso control de calidad. El TaqMan GMO Screening kit ha superado todas las pruebas de validación internas, que garantizan la fiabilidad y reproducibilidad de cada ensayo. Puede consultar el Certificado de Análisis correspondiente a su kit, introduciendo el número de lote del producto en la sección de Kits de Análisis de la web 10. Garantías y responsabilidades El Instituto de Medicina Genómica le garantiza que todos sus productos están libres de defectos, tanto en los materiales empleados como en su proceso de su fabricación. Esta garantía se hace extensible a un período de un año desde la fecha de envío del producto, siempre que se observen las condiciones de conservación especificadas en este Manual. Nuestros productos están diseñados para uso en investigación. El usuario de los productos es responsable de validar la utilidad de los protocolo propuestos por el Instituto de Medicina Genómica. Dichos protocolos se consideran únicamente una guía. El Instituto de Medicina Genómica no le ofrece ninguna otra garantía, expresa o implícita, que se extienda más allá del funcionamiento correcto de los componentes de este set. La única obligación del Instituto de Medicina Genómica, respecto de las garantías precedentes, será la de reemplazar los productos, o bien devolver el precio de la compra de los mismos, a voluntad del cliente, siempre y cuando se pruebe la existencia de un defecto en los materiales, o bien en la elaboración de sus productos. El Instituto de Medicina Genómica no será responsable de ningún daño, directo o indirecto, que resulte en pérdidas económicas o en daños que pudieran producirse por el uso de este producto por parte del comprador o usuario. 13. Servicio de atención al cliente Para cualquier consulta sobre las aplicaciones de este producto o sobre sus protocolos, puede contactar con nuestro Departamento Técnico: Teléfono: Mail: Rev /12

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