CLASE DE RESOLUCIÓN DE PROBLEMAS DE PCR LIC. BIOTECNOLOGÍA 2015

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1 CLASE DE RESOLUCIÓN DE PROBLEMAS DE PCR LIC. BIOTECNOLOGÍA 2015

2 DEFINICIÓN PCR: Constituye la técnica más importante para amplificar ácidos nucleicos in vitro. Ambas hebras del DNA de interés son replicadas exponencialmente mediante síntesis enzimática dirigida por una DNA polimerasa termoestable que es cebada por dos oligonucleótidos (cebadores o primers) y por el agregado de los desoxirribonucleótidos.

3 APLICACIONES DE LA PCR Y SUS VARIANTES: DIAGNÓSTICO/FORENSE: IDENTIFICACIÓN, PRESENCIA O AUSENCIA DE UNA SECUENCIA DE ADN BLANCO. GENERACIÓN DE SONDAS/ NIVELES DE EXPRESIÓN: TRANSCRIPCIÓN REVERSA PCR. CLONADOS MOLECULARES

4 PROBLEMA DE PCR CLÁSICO (EJ. APLICACIÓN DIAGNÓSTICO) (3) La siguiente secuencia obtenida por RT-PCR, corresponde a la región 5 no codificante del cadn del virus de la hepatitis C (VHC). Se desea desarrollar un protocolo de amplificación por PCR de dicha secuencia que será utilizado para el diagnóstico de infección por VHC. 5...GTGAGGAACTACTGTCTTCACGCAGAAAGCGTCTAGCCATGGCGTTAGTAT GCCTTGTGGTACTGCCTGAT AGGGTCGTTGCGAGTGCCCCGGGAGGTCTCGTAGACCGTGCACCATGAGCA...3 a- Diseñe un par de cebadores adecuados (n 22) y un protocolo de PCR que permitan la amplificación de la región de interés. Marque claramente en qué región hibridan los oligonucleótidos diseñados y su T M. b- Indique el tamaño del producto de amplificación obtenido y qué sistema utilizaría para visualizarlo. c- Qué control diseñaría para evaluar la presencia de sustancias inhibitorias en la muestra de un paciente a procesar? d- Realice un esquema de las bandas que visualizaría en un gel (de las características especificadas en el ítem b) en el que se corrieron las siguientes muestras: calle 1: control negativo. calle 2: control positivo. calle 3: muestra de un paciente positivo para VHC (obtenida con EDTA). calle 4: muestra de un paciente positivo para VHC (obtenida con heparina). calle 5: marcador de tamaño molecular de tipo Ladder 100 pb.

5 PCR CLÁSICA

6 a- Diseñe un par de cebadores adecuados (n 22) y un protocolo de PCR que permitan la amplificación de la región de interés. Marque claramente en qué región hibridan los oligonucleótidos diseñados y su T M. 5...GTGAGGAACTACTGTCTTCACGCAGAAAGCGTCTAGCCATGGCGTTAGTAT G CCTTGTGGTACTGCCTGATAGGGTCGTTGCGAGTGCCCCGGGAGGTCTCGTAGACCGTGCAC CATGAGCA ACTATCCCAGCAACGCTCAC 5 Cebador directo: 5 TACTGTCTTCACGCAGAAAGC 3 T M : 11x2 + 10x4 = 62 C; 21 nt Cebador reverso: 5 CACTCGCAACGACCCTATCA 3 T M : 9x2 + 11x4 = 62 C; 20 nt b- Indique el tamaño del producto de amplificación obtenido y qué sistema utilizaría para visualizarlo. Tamaño del producto: 258 pb. Se puede visualizar en gel de agarosa al 2% (p/v).

7 c- Qué control diseñaría para evaluar la presencia de sustancias inhibitorias en la muestra de un paciente a procesar? d- Realice un esquema de las bandas que visualizaría en un gel (de las características especificadas en el ítem b) en el que se corrieron las siguientes muestras:

8 PROBLEMA DE TRANSCRIPCIÓN REVERSA SEGUIDA DE PCR (EJ. NIVEL DE EXPRESIÓN) (7) Usted desea comprobar si el gen biot se expresa en tejido hepático sometido a una droga mutagénica. Utilizando un programa de computación usted realizó el diseño de cebadores para amplificar un fragmento del cadn de longitud entre 100 y 300 pb. La siguiente secuencia de ADN genómico corresponde a una parte del gen biot que incluye un intrón (indicado en letra cursiva: 282 pb) que abarca desde el nucleótido 2779 al Los cebadores diseñados por el programa se encuentran subrayados en la secuencia y numerados del 1 al 6 entre paréntesis arriba de la secuencia doble hebra del ADN (1) (2) ACGTTTGCACGGATCCGATTAAACAGTACGAGTGGTCACATGGGCGGCTCTCAGATCAT 3 -TGCAAACGTGCCTAGGCTAATTTGTCATGCTCACCAGTGTACCCGCCGAGAGTCTAGTA TAGTCACAC pb tagcccacacatag ATCAGTGTG ATCGGGTGTGTATC (3) TGCTGCACTCCCGGGATATATTGACACTGC pb agat ACGACGTGAGGGCCCTATATAACTGTGACG TCTA (4) 3571 AACGTTGACCGTACGGTACCTTGGAACCCATGCGTACTGTGGGCGGCTCTCAGATCATGCA TTGCAACTGGCATGCCATGGAACCTTGGGTACGCATGACACCCGCCGAGAGTCTAGTACGT (5) 3591 (6) CATGCATGCACCAATGACCA pb ccggtcaccat GTACGTACGTGGTTACTGGT GGCCAGTGGTA ACACGTGTCGCACGCACTACTA-3 TGTGCACAGCGTGCGTGATGAT-5 a- Qué material de partida utilizaría para realizar el análisis de la expresión? b- Qué método utilizaría para medir la expresión del gen biot? Explique y justifique la metodología. c- Qué controles son necesarios para la interpretación de los resultados de la expresión del gen biot? d- Escriba las secuencias de todos los oligonucleótidos y calcule las T M de los mismos. e- Qué par de cebadores elegiría y cuáles no? Considere todos los pares de cebadores posibles y justifique su elección o no en cada caso. f- Calcule el tamaño del fragmento amplificado con el par de cebadores elegidos y diseñe un programa de PCR adecuado para llevar a cabo la reacción. g- Si su muestra estuviera contaminada con ADN genómico, los cebadores seleccionados le servirían para distinguir esta contaminación? Justifique. h- Proponga la amplificación de un producto que distinga tal situación.

9 RT-PCR:

10 a- Qué material de partida utilizaría para realizar el análisis de la expresión? RNA TOTAL O FRACCIÓN POLI-A DEL RNA DE EXTRACTO DE HÍGADO b- Qué método utilizaría para medir la expresión del gen biot? Explique y justifique la metodología. TÉCNICAS PARA DETERMINAR NIVELES DE EXPRESIÓN GÉNICA NORTHERN BLOT RT-PCR c- Qué controles son necesarios para la interpretación de los resultados de la expresión del gen biot? CONTROL NEGATIVO CONTROL POSITIVO CONTROL INTERNO CONTROL DE AUSENCIA DE ADN GENÓMICO d- Escriba las secuencias de todos los oligonucleótidos y calcule las T M de los mismos. Cebador 1: TTTGCACGGATCCGA T M = 46 C Cebador 2: GGCGGCTCTCAGATCAT T M = 54 C Cebador 3: GCAGTGTCAATATATCCCGGG T M = 64 C Cebador 4: ACCGTACGGTACCTTGG T M = 54 C Cebador 5: TGGTCATTGGTGCATGC T M = 52 C Cebador 6: CGTGTATGGTGACCGG T M = 52 C

11 e- Qué par de cebadores elegiría y cuáles no? Considere todos los pares de cebadores posibles y justifique su elección o no en cada caso (1) (2) ACGTTTGCACGGATCCGATTAAACAGTACGAGTGGTCACATGGGCGGCTCTCAGATCAT 3 -TGCAAACGTGCCTAGGCTAATTTGTCATGCTCACCAGTGTACCCGCCGAGAGTCTAGTA TAGTCACAC pb tagcccacacatag ATCAGTGTG ATCGGGTGTGTATC (3) TGCTGCACTCCCGGGATATATTGACACTGC pb agat ACGACGTGAGGGCCCTATATAACTGTGACG TCTA (4) 3571 AACGTTGACCGTACGGTACCTTGGAACCCATGCGTACTGTGGGCGGCTCTCAGATCATGCA TTGCAACTGGCATGCCATGGAACCTTGGGTACGCATGACACCCGCCGAGAGTCTAGTACGT (5) 3591 (6) CATGCATGCACCAATGACCA pb ccggtcaccat GTACGTACGTGGTTACTGGT GGCCAGTGGTA 1-3 hibrida sobre intrón 1-5 tamaño pdto tamaño pdto 4-6 ACACGTGTCGCACGCACTACTA-3 TGTGCACAGCGTGCGTGATGAT-5 f- Calcule el tamaño del fragmento amplificado con el par de cebadores elegidos y diseñe un programa de PCR adecuado para llevar a cabo la reacción. Tamaño amplificado: 294 pb ciclos de: Desnaturalización: 45 s a 94 C Anillado: 45 s a 48 C Elongación: 30 s a 72 C Elongación final: 5-10 min a 72 C

12 g- Si su muestra estuviera contaminada con ADN genómico, los cebadores seleccionados le servirían para distinguir esta contaminación? Justifique. h- Proponga la amplificación de un producto que distinga tal situación. Ó producto de mayor tamaño cebadores 1 y 5 pdto 859 pb sobre molde de ADN genómico (incluye el intrón) pdto 577 pb sobre molde de cadn.

13 PROBLEMA DE PCR PARA CLONADO MOLECULAR (3) Usted desea amplificar por PCR un gen bacteriano cuya secuencia se muestra a continuación (se subrayan los sitios de inicio y terminación de la traducción). HindIII 5 GGT CCC AAG CGA ATG TTC GGT CAG GAA CTG -582 nt- ACA TAA AAG CTT ATC TTC AGC TGC ATT 3 La proteína que codifica se debe obtener con todos los aminoácidos y se la quiere purificar introduciendo un tag de histidina amino terminal, para lo cual se realizará el clonado en el vector pet28. En el laboratorio se dispone sólo de las enzimas HindIII, BamHI y EcoRI, las cuales no se encontraron en la secuencia codificante. a- Diseñe los oligonucleótidos que usará, introduciendo sitios de restricción para realizar el clonado en el vector pet28, teniendo en cuenta que tengan temperaturas de anillado similares. b- Especifique cómo se induce la expresión, cuántos aminoácidos tendrá la proteína y cómo puede purificarla. c- Cómo puede eliminar la cola de histidina una vez purificada la proteína?

14 a- Diseñe los oligonucleótidos que usará, introduciendo sitios de restricción para realizar el clonado en el vector pet28, teniendo en cuenta que tengan temperaturas de anillado similares. Enzimas en el laboratorio: BamHI: G GATCC EcoRI: G AATTC HindIII: A AGCTT 5 GGT CCC AAG CGA ATG TTC GGT CAG GAA CTG 582 nt ACA TAA AAG CTT ATC TTC AGC TGC 3 Hind III

15 BamHI: G GATCC EcoRI: G AATTC HindIII: A AGCTT 5 GGT CCC AAG CGA ATG TTC GGT CAG GAA CTG 582 nt ACA TAA AAG CTT ATC TTC AGC TGC 3 Posibles combinaciones: D: BamHI - R: EcoRI D:BamHI - R: HindIII (A) D: EcoRI - R: HindIII (B) OLIGO REVERSO: 5 GCTGAAGATAAGCTTTTATG 3 Hind III Ta= Tm 4 C= ((4x7)+(2x13)) 4 C= 50 C; 20 nt.

16 OPCIÓN A: oligo directo con sitio para BamHI incorporando missmatches BamHI: G GATCC A T 5 GGT CCC AAG CGA ATG TTC GGT CAG GAA CTG 582 nt ACA TAA AAG CTT ATC TTC AGC TGC 3 OLIGO DIRECTO: 5 NNNGGATCCAAGCGAATGTTCGG 3 Ta= (Tm 4 C x missmatch) 4 C= ((4x11)+(2x9)) (2 x 4 C) 4 C= 50 C; 23 nt. GATCCAAGCGAATG.

17 OPCIÓN B: oligo directo con sitio para EcoRI incorporando el sitio de restricción entero. EcoRI: G AATTC 5 GGT CCC AAG CGA ATG TTC GGT CAG GAA CTG 582 nt ACA TAA AAG CTT ATC TTC AGC TGC 3 OLIGO DIRECTO: 5 NNNGAATTCATGTTCGGTCAGGAACTG 3 Ta= (Tm 4 C) = ((4x9)+(2x9)) 4 C= 50 C; 27 nt. AATTCATG.

18 b- Especifique cómo se induce la expresión, cuántos aminoácidos tendrá la proteína y cómo puede purificarla. Para expresar la proteína recombinante se transformará una cepa de Escherichia coli como la BL21(DE3) la cual posee el gen que codifica para la T7 ARN polimerasa. Esta enzima reconoce el promotor del bacteriófago T7 que dirige la expresión del gen de interés en el vector derivado de la serie pet28. La expresión será inducida mediante el agregado de IPTG (isopropil-β- D-tiogalactósido) el cual se une al represor LacI y libera el sitio de unión para la RNA polimerasa en el promotor. La proteína de fusión tendrá 237 aminoácidos en ambas opciones de clonado. La secuencia de polihistidinas amino terminal de la proteína recombinante permitirá purificarla selectivamente mediante una columna cromatográfica con resina de Ni-NTA. La proteína se eluye con imidazol.

19 OPCIÓN A: oligo directo con sitio para BamHI incorporando missmatches 5 GGT CCC AAG CGA ATG TTC GGT CAG GAA CTG 582 nt ACA TAA AAG CTT ATC TTC AGC TGC 3 10 aa aa + 1 aa + 29 aa + 3 aa = 237 aa

20 OPCIÓN B: oligo directo con sitio para EcoRI incorporando el sitio de restricción entero. 5 GGT CCC AAG CGA ATG TTC GGT CAG GAA CTG 582 nt ACA TAA AAG CTT ATC TTC AGC TGC 3 8 aa aa + 1 aa + 29 aa + 5 aa = 237 aa

21 c- Cómo puede eliminar la cola de histidina una vez purificada la proteína? El hexámero de histidinas amino terminal se puede eliminar de la proteína purificada mediante un tratamiento de proteólisis con trombina.

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