Comprobando la calidad del DNA genómico mediante electroforesis en gel

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1 Comprobando la calidad del DNA genómico mediante electroforesis en gel GELES 1 Y 2 Agarosa 0.8 %, electroforesis a 1 V/cm Muestras: Se ha cargado muestras de DNA genómico no digerido, antes (líneas impares) y después (líneas pares) del tratamiento con RNAsa. La mayor parte del DNA se encuentra en la zona de alto peso molecular. Todas las muestras tienen una calidad suficiente para el experimento de Southern blot.

2 Confirmando la identidad de los plásmidos mediante digestión. Kpb Geles 1 % Agarosa, electroforesis 4 V/cm. Para las digestiones se utilizaron 5 μl de plásmido de un total de 30. Carril 1. Marcador de peso molecular Carriles 2 a 6. pmrp digerido con distintas enzimas y no digerido (2) Carriles 7 a 11. pgus digerido con distintas enzimas y no digerido (7) Carriles 12 a 16. pas1 digerido y no digerido (12) Carriles 17 a 20. pta794 digerido con distintas enzimas y no digerido (17) Todas las digestiones coinciden con los mapas disponibles.

3 Amplificación y marcaje para la preparación de las sondas Gel 1 % Agarosa, electroforesis 4 V/cm. Se cargaron 1 μl de cada reacción de PCR, de un total de 10. Carril 1, Marcador de peso molecular Carriles 2 a 5. Amplificación del inserto de pmrp con cebadores específicos de su secuencia codificante. Las reacciones 4 y 5 contenían DIG-dUTP. Carriles 6 a 9. Amplificación del inserto de pgus con cebadores específicos de pbsk. Las reacciones 6 y 7 contenían DIG-dUTP (no funcionaron). Carriles 10 a 13. Amplificación del inserto de pas1 con cebadores específicos de puc19. Las reacciones 10 y 11 contenían DIG-dUTP (no funcionaron). Carriles 14 a 16. Amplificación del inserto de pta794 con cebadores específicos de pbr322. Las reacciones 15 y 16 contenían DIG-dUTP.

4 Hibridación con pas1 Gel 1.2 % agarosa, electroforesis a 1 V/cm. 1. Marcador de peso molecular (300ng frío + 5 ng marcado con DIG). 2. DNA de maíz cortado con EcoRI 3. DNA de maíz cortado con EcoRI 4. DNA de maíz cortado con EcoRI 5. DNA de maíz cortado con EcoRI 6. DNA de T. monococcum cortado con EcoRI 7. DNA de cebada cortado con EcoRI El panel de la izquierda muestra una fotografía del gel teñido con bromuro de etidio (5 µg de DNAg por muestra). El de la derecha corresponde al resultado de la hibridación de ese DNA con pas-1. Exposición de la película 1 min. La sonda procede de una especie silvestre de trigo y representa a una familia de DNA repetido disperso sin función conocida. La intensidad de la hibridación se corresponde con las relaciones filogenéticas de los materiales estudiados, siendo maíz (que no muestra señal de hibridación con la sonda) el más alejado de trigo.

5 Hibridación con pta794 Gel 1.5 % agarosa, electroforesis a 1 V/cm. 1. Marcador de peso molecular (300ng frío + 5 ng marcado con DIG). 2. DNA de maíz cortado con BamHI 3. DNA de maíz cortado con EcoRI 4. DNA de T. monococcum cortado con EcoRI 5. DNA de cebada cortado con EcoRI 6. Marcador de peso molecular (300ng frío + 5 ng marcado con DIG). 7. DNA de maíz cortado con EcoRI 8. DNA de maíz cortado con BamHI 9. DNA de maíz cortado con BamHI 10. DNA de maíz cortado con BamHI 11. DNA de T. monococcum cortado con BamHI 12. DNA de cebada cortado con BamHI El panel de la izquierda muestra una fotografía del gel teñido con bromuro de etidio (5 µg de DNAg por muestra). El de la derecha corresponde al resultado de la hibridación de ese DNA con la sonda pta794. Exposición de la película 1 min. El clon pta794 contiene una de las copias del gen del RNA ribosomal 5S. Estas secuencias se organizan en el genoma en forma de clusters que contienen cientos de copias repetidas en tandem. La digestión del DNA genómico con una enzima (BamHI) que corta en cada una de las unidades repetidas genera una escalera de bandas debido a no utilización ocasional de alguno de los blancos. La heterogeneidad en el patrón de la escalera de bandas en las distintas especies denota heterogeneidad en el tamaño de la

6 unidad repetida en cada una, seguramente debido a heterogeneidad en el tamaño de la región espaciadora entre genes (el gen 5S está muy conservado). La digestión con una enzima (EcoRI) que no corta dentro de las unidades repetidas da lugar a fragmentos de DNA que potencialmente contienen todo el cluster.

7 Hibridación con pgus Gel 0.8 % agarosa, electroforesis a 1 V/cm. 1. Marcador de peso molecular (300ng frío + 5 ng marcado con DIG). 2. DNA de maíz cortado con HindIII 3. DNA de maíz cortado con HindIII 4. DNA de maíz cortado con HindIII 5. DNA de maíz cortado con HindIII 6. DNA de maíz cortado con HindIII 7. DNA de maíz cortado con HindIII 8. DNA de maíz cortado con HindIII 9. DNA de maíz cortado con HindIII 10. DNA de maíz cortado con HindIII 11. DNA de maíz cortado con HindIII 12. DNA de T. monococcum cortado con HindIII 13. DNA de cebada cortado con HindIII El panel de la izquierda muestra una fotografía del gel teñido con bromuro de etidio (Se utilizaron 15 µg de DNAg). El de la derecha corresponde al resultado de la hibridación de ese DNA con la sonda pgus. Exposición de la película 1h 30 min. Todos los maíces contienen el gen delator GUS, en distinto número de copias y disposiciones. El gen delator no aparece en el genoma de trigo pero si en el de cebada (era transgénica).

8 Hibridación con la sonda pmrp Gel 0.8 % agarosa, electroforesis a 1 V/cm. 1. Marcador de peso molecular (300ng frío + 5 ng marcado con DIG). 2. DNA de maíz (Línea 1a) cortado con HindIII 3. DNA de maíz (Línea 2a) cortado con HindIII 4. DNA de maíz (Línea 3a) cortado con HindIII 5. DNA de maíz (Línea 5a) cortado con HindIII 6. DNA de maíz (Línea 6a) cortado con HindIII 7. DNA de maíz (Línea 8a) cortado con HindIII

9 8. DNA de maíz (Línea 9a) cortado con HindIII 9. DNA de maíz (Línea 10a) cortado con HindIII 10. DNA de maíz (Línea 11a) cortado con HindIII 11. DNA de maíz (Línea 12a) cortado con HindIII 12. DNA de maíz (Línea 13a) cortado con HindIII 13. DNA de maíz (Línea 14a) cortado con HindIII 14. DNA de maíz (Línea 15a) cortado con HindIII 15. DNA de maíz (Línea 16a) cortado con HindIII 16. DNA de T. monococcum cortado con HindIII 17. DNA de cebada cortado con HindIII El panel superior muestra una fotografía del gel teñido con bromuro de etidio (Se utilizaron 15 µg de DNAg). El inferior corresponde al resultado de la hibridación de ese DNA con la sonda pmrp-1. Exposición de la película 1 hora 30 min. Todos los maíces contienen MRP-1, y todos (excepto la línea 15a) contienen la versión transgénica de MRP-1 (banda de menor peso molecular). En trigo y cebada no se detecta ninguna secuencia relacionada con MRP-1.

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