Usos de Herramientas Moleculares en Agricultura: Marcadores Moleculares. Técnicas Moleculares. Técnicas Moleculares 8/13/13

Transcripción

1 8/13/13 Usos de Herramientas Moleculares en Agricultura: Marcadores Moleculares CAF516 O Recursos Genéticos y Biotecnología 14 Agosto 2013 Técnicas Moleculares Aplicaciones en muchas disciplinas Generan mucha información No solución para todo En general, requiere extracción de ácidos nucleicos, proteína, o metabolito y después Amplificar Cortar por PCR con enzimas Ambos Separar fragmentos por electroforesis Técnicas Moleculares Técnica Molécula Electroforesis Southern ADN Sí Northern ARN Sí Western Proteína Sí ELISA Proteína No 1

2 Técnicas Moleculares Técnica Molécula Electroforesis PCR ADN o ARN Sí PCR-Tiempo Real ADN o ARN No Otras, Sistema Capilar o gel EF con Fluorocromo Proteína, ADN Sí, sin tinción Procesos Esenciales Extracción de Ácidos Nucleicos Electroforesis Extracción de Ácid. Nucl. Maceración de tejido en buffer Mantiene ADNasas o ARNasa inactivas Incubación 65C Fenol/Cloroformo Separación proteína y celulosa Fase acuosa se mezcla con alcohol AcidNucl se resuspenden en buffer (TE) Se añade ADNasa o ARNasas (según el caso) 2

3 Extracción de Ácid. Nucl. Maceración (LN2) Agregar Buffer - Durante o Después de Maceración Incubación 65C Alcohol, Precipitación o Enganchar, Resuspender en Buffer Mezclar con Fenol/Cloroformo, Centrifugar, Separar Fase Acuosa Electroforesis Separación de fragmentos por tamaño (peso molecular) Fragmentos pasan por un medio gelatinoso Agarosa Acrilamida Algún polimero (sistema capilar) Buffer especial (lo más nuevo, Shimadzu) Carga electrica Muchas veces requiere tinción Extracción ADN 3

4 Técnicas Moleculares: Cuantificación y Electroforesis Electroforesis separa fragmentos de ADN por tamaño Separación de fragmentos Tinción Métodos Después de Extracción Soutern, Northern, Western PCR, RT-PCR 4

5 Técnicas Moleculares Clásicas Southern Blot o hibridación Southern Detección de secuencia, marcador molecular ADN cortado con enzimas de restricción (Ej: EcoRI) Técnicas Moleculares Clásicas Southern Blot o hibridación Southern Detección de secuencia, marcador molecular ADN cortado con enzimas de restricción (Ej: EcoRI) Cortan ácidos nucleícos Corre en electrophoresis Se baña en sonda radioactiva Fragmento de ADN Revela radiografía Técnicas Moleculares Clásicas Southern Blot o hibridación Southern Detección de secuencia, marcador molecular ADN cortado con enzimas de restricción (Ej: EcoRI) Cortan ácidos nucleícos Corre en electrophoresis Se baña en sonda radioactiva Fragmento de ADN Revela radiografía 5

6 Técnicas Moleculares Clásicas Determina niveles de expresión (ARNm) Extraer ARNm del tejido de interés Separar en un gel Incubar con sondas radio-etiquetadas + ARNm = + transx = + señal 13-agos-13 Northerns Ejemplos agos Yema Latente Resultados: Northern Blots Ambos VFL y VvTFL1 son específicos al ápice VvTFL1 Se activa sólo en Sept y Oct VFL (LFY) activo en Dic, y en March 13-agos-13 6

7 Técnicas Moleculares Clásicas Western Detección de proteínas Muy parecido a northern o Southern Proteínas Separación en acrilamida Anticuerpos específicos radioactivos Autorradiografía Métodos PCR RT-PCR 7

8 8/13/13 Concepto Básico en Biol Mol PCR Reacción Produce Técnica en cadena de la polimerasa copias de segmento(s) específico(s) de ADN base para varios métodos Secuenciación Marcadores PCR moleculares tiempo real (RT-PCR) Perfiles moleculares (caracterización) Replicación (Procariotas) Ingredientes de la PCR ADN de interés ADN Iniciadores (oligonucléotidos) ADN Taq polimerasa (termoestable) (dntps); nucleótidos de A, G, T, y C TAQ Primers Buffer ph Cationes (MgCl2, K+) datp dgtp dctp dttp

9 PCR: Reacción en Cadena de la Polimerasa Paso 1: desnaturalización Cebadores Cebadores Paso 2: alineamiento Paso 3: extensión PCR: Reacción en Cadena de la Polimerasa Paso 1: desnaturalización Cebadores Cebadores Paso 2: alineamiento Paso 3: extensión PCR: Reacción en Cadena de la Polimerasa Paso 1: desnaturalización Cebadores Cebadores Paso 2: alineamiento Paso 3: extensión 9

10 PCR Electroforesis Separados en gel por corriente eléctrica Separa por pesos moleculares (tamaño) Observación de fragmentos mediante tinción Concepto Básico PCR Copias de segmentos se separan por tamaño (electroforesis) Fragmentos pequeños se movilizan más rápido 10

11 Electroforesis: 1) Geles de agarosa 2) Geles de acrilamida Animaciones PCR Electroforesis gelelectrophoresis.html RT-PCR PCR tiempo real lo está remplazando PCR-TR también remplazando ELISA Complementando métodos tradicionales de detección de patógenos y antagonistas Otras aplicaciones Mejoramiento genético 11

12 PCR-Tiempo Real Para detectar y cuantificar Virus de ARN, ADN, hongos, bacterias, nematodos Mezcla de especies 4 organismos diferentes a la vez (Modelo ABI) Extracción directa de hoja con hongo, raíz con nematodo, etc. PCR-Tiempo Real Similar a PCR convencional Excepción: excita y mide fluorescencia Esencialmente dos tipos marcadores fluorescenctes SYBR green Sonda Taqman ADN en concentración más alta, fluorescencia máxima se alcanza más pronto PCR-Tiempo Real SYBR green Intercala entre nucleotidos de ADN Cuando intercala fluorescencia Mientras amplificación ocurre, fluorescencia incrementa Sonda Taqman Oligonucleotido con un reportero y un neutralizador Amplificación desplaza sonda y separa reportero de neutralizador 12

13 SYBR green SYBR green Inactivo SYBR green Fluorescencia Taqman PCR-Tiempo Real-SYBR vs Taqman SYBR Barato No requiere diseño de sonda No requiere información de secuencia Taqman Detección multiple por reacción Diff reporteros Sin secuencia no se puede diseñar sonda 13

14 PCR-Tiempo Real Información Detecta presencia de fragmento específico Detecta diferencias de concentración de tal fragmento Genera información más rápido y seguro No requiere visualizar en gel No requiere teñir con bromuro de etidio PCR-Tiempo real Concentración ADN Curvas de Estandarización 14

15 PCR-Tiempo Real Aplicación de RT-PCR en detección y cuantificación de hongos Filion et al Detección y cuantificación de Fusarium solani y posible antagonista Glomus intraradices (micorriza) Extracción ADN directamente de raíz inoculada y suelo (rizósfera) PCR-tiempo real usando SYBR green Glomus controla Fusarium directamente de la raíz + Marcadores Moleculares: Las Técnicas, Sus Aplicaciones y Limitaciones Lección 5 5 Septiembre

16 + Marcadores Moleculares + Marcadores Genéticos Qué es un marcador molecular: Diferencias en el ADN Pueden visualizarse entre individuos Nacen por diferentes clases de mutaciones En general, asocia el marcador a caracteres importantes + Aplicaciones de Marcadores Mapeo genético QTLs Mapeo de genes Clonación genética basada en mapas Mapa genético Mapa físico Selección asistida por marcadores (MAS) Selecció no invasiva Análisis de diversidad genética 16

17 + Marcadores Genéticos Clasificación de marcadores Dominantes Binario, Presencia/Ausencia Codominantes Posibles alelos pueden visualizarse Número de alelos por individuo dependerá de ploidía + Marcadores Genéticos Dominantes Amplificación de regiones o loci desconocidos Generales i.e. no específicos a especie Usualmente generan muchas bandas + Marcadores Genéticos Codominantes Generan pocas bandas Específicos a especie u otras relacionadas Regiones o loci conocidos 17

18 + Marcadores Genéticos Codominantes Ventajas Análisis finos Heterocigocidad, frecuencia de alelos, equilibrio HW, etc. Comparativos Información transferible Desventajas Poca información por reacción Requiere conocimiento previo Diversidad limitada a uno o dos loci + Marcadores Genéticos Codominantes Ventajas Análisis finos Heterocigocidad, frecuencia de alelos, equilibrio HW, etc. Comparativos Información transferible Desventajas Poca información por reacción Requiere conocimiento previo Diversidad limitada a uno o dos loci Dominantes Ventajas Genera mucha información por marcador Diversidad a nivel genómico No requiere conocimiento previo Desventajas Limitación de análisis Información binaria Fragmentos que coinciden en tamaño pueden ser diferentes Información no transferible + Técnicas Moleculares: Bases de Marcadores Extracción Ácidos Nucleicos Cortes Enzimáticos PCR Combinación Cortes y PCR Secunciación 18

19 + Técnicas Moleculares: Bases de Marcadores Extracción Ácidos Nucleicos Cuantificación y Electroforesis Cortes Enzimáticos PCR Combinación Cortes y PCR Secunciación Electroforesis Electroforesis Electroforesis RT-PCR Sondas* + Marcadores Genéticos + Marcadores Genéticos 19

20 + Marcadores Genéticos + Marcadores Que Cubriremos Dominantes: ADN polimórfico amplificado al azar Amplified Fragment Length Polymorphisms (AFLP) Polimorfismos de longitud de fragmentos amplificados Inter Simple Sequence Repeat (ISSR) Secuencias Simples Inter Repetidas + Marcadores Que Cubriremos Codominantes: Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP; no PCR) Polimorfismos de longitud por restricción de fragmentos Repetición de secuencia simple Expressed Sequence Tags (EST) Etiquetas de secuencia expresada Single Nucleotide Polymorphisms (SNP) Polimorfismos de un sólo nucleotido 20

21 + Dominantes + Rapidly Amplified Polymorphic DNA (RAPD) Un imprimador funciona como forward y reverse 10 bases al azar Varios segmentos amplificados sobre regiones desconocidas + Randomly Amplified Polymorphic DNA (RAPDs) Amplificación anónima de fragmentos usando primers arbitrarios 21

22 + Randomly Amplified Polymorphic DNA (RAPDs) + Ventajas/Desventajas No requiere información previa Reporducibilidad inconsistente Fáciles y rápidos de ejecutar Genera relativamente mucha información a bajo costo Separación en agarosa Mismo primer funciona en muchos organismos Generalista + Codominantes 22

23 + Simple Sequence Repeats (SSRs) Se conocen también por microsatélites Repeticiones tandem de fragmentos de ADN (ctctctct ) Número de repeticiones varía En abundancia alrededor del genoma Específicos Usualmente una copia por genoma haploide + SSR Razón por lo que ocurren: Resbalón de la polimerasa + Simple Sequence Repeats (SSRs) 23

24 + + Ventajas/Desventajas Secuencia conservada entre miembros a nivel phylum Altamente transferibles Relativamente fáciles de ejecutar Existencia de varios alelos Transferencias no siempre son perfectas Generación de bandas inespecíficas Repetición genera resbalones Casi siempre requiere separación fina en acrilamida + Single Nucleotide Polymorphism (SNP) Cuando existe una diferencia en un sólo nucleotido en la misma posición de la secuencia Es considerado una gran fuente genética de variación fenotípica Ocurre en intrones como en exones 24

25 + Single Nucleotide Polymorphism (SNP) Métodos para detectar SNP Secuenciar RT-PCR Genotipado por secuenciación + PCR-Tiempo Real: SYBR Green o LCGreen Plus Usando sonda no marcada Montgomery et al Marcador Req. Secuencia Fragmentos Transferencia informativa RFLP No Pocos/Específicos Depende de sonda RAPD No Varios Población ISSR No Varios Población SSR Sí Pocos/Específicos Phylum AFLP No Muchos Población SNP Sí Pocos/Específicos Phyllum-Orden EST Sí Pocos/Específicos Phyllum-Orden 25

26 + Marcador Ventaja Desventaja RFLP RAPD ISSR SSR AFLP SNP EST Se descubre secuencia Genera información fácil y no requiere secuencia Genera información fácil y no requiere secuencia, más reproducibles que RAPD Transferibles, se puede hacer referencia de géneros muy distintos en una familia Genera mucha información en relativamente poco tiempo Mayoría de variación existente Está asociado a genes que codifican una proteína Genera poca información y laboriosos Problemas con reproducibildad de resultados Menos generalistas que RAPD Resbalones, poca información a nivel genoma No transferible, requiere varios pasos Requiere secuenciar, RT-PCR, u otros métodos Requiere información de genes + Como Usar Micropipetas + Como Chorrear un Gel 26

27 + Como Cargar Muestras al Gel + Como Preparar un PCR 27