Marcadores Bioquímicos: Isoenzimas y Proteínas de Reserva

Transcripción

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3 Marcadores morfológicos Influencia del ambiente Bajo número Caracteres de madurez Entrenamiento y subjetividad Marcadores moleculares Sin influencia ambiental Cantidad ilimitada Análisis en fases tempranas Sencillos, rápidos y objetivos

4 Marcadores Bioquímicos: Isoenzimas y Proteínas de Reserva

5 Extracción Electroforesis Tinción Interpretación

6 Extracción Métodos NO agresivos. Sin Desnaturalización Procesos sencillos, rápidos y poco limpios Electroforesis Se detectan diferencias en la carga neta de las isoenzimas Geles de almidón o acrilamida Duración de 4 a 8 horas

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10 Tinción Substrato Enzima Producto Cromógeno Color

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12 Control Genético de Isoenzimas Aconitasa: dos loci, cada uno con dos alelos activos

13 ACPH

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15 Ventajas de las isoenzimas Método robusto y reproducible Herencia mendeliana codominante Están poco o nada influenciadas por el ambiente Rápido y simple Bajo coste

16 Desventajas de las isoenzimas Número limitado (<30) No analiza directamente el material hereditario Se analizan únicamente genes estructurales con información para proteínas solubles (no es una muestra al azar del genoma)

17 Marcadores Moleculares

18 AISLAMIENTO DE ADN REACCIONES ENZIMATICAS MUESTRAS ELECTROFORESIS + - GEL RESULTADOS MARCADORES MOLECULARES

19 RFLPs Restriction Fragment Length Polymorphisms Alelo A Diana de restricción 600pb Diana de restricción 300pb Diana de restricción Alelo B 900pb Mutación

20 RFLPs Detección mediante Hibridación Southern

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27 PCR-RFLPs PCR 600pb 300pb 900pb Digestión Electroforesis AA AB BB MARCADOR DIALELICO CODOMINANTE

28 Genotipado PCR-RFLP Extracción de ADN Amplificación por PCR Digestión del producto de amplificación Electroforesis de los fragmentos Interpretación de los genotipos Almacenamiento de la información

29 1 cccgggggac atgaccccag aggaggagcg ggaacaggat gagtgggagg aggttctaaa 61 ttatccatta gcacatgcct gccagtgggc catgcataaa tgtatagaga aaataggtgg 121 gggcagaggg agagagaaga ggccagggta taaaaagggc ccaaaaggga ccaattccag 181 aatcccagga cccagctccc cagaccactc agggacctgt ggacagctca ccggctgtga 241 tggctgcagg caagtgcccc taaaatccca gtggcttggt gtgttctgaa gggtgacgtg 301 ggggccatgc agatggatgg ggcaccaacc ttgggctttg gggtttccga atgtgagcat 361 ggatatctac tcctagatat gaggccaagt tttaaatgtc cctgggggag ggggaggaga 421 agggacaggg ctggtggagc caggcctctt gtctctggga tccctctctc acgggccctc 481 ctggtctcta ggccctcgga cctccgcgct cctggctttc gccctgctct gcctgccctg 541 gactcgggag gtgggcgcct tcccagccat gcccttgtcc agcctatttg ccaacgccgt 601 gctccgggcc cagcacctgc accaactggc tgctgacacc tacaaggagt ttgtaagctc 661 cccagggagg gtgctggagg ggggtggtgg agag Secuencias de hibridación de los cebadores Exón 1 Exón 2 Dianas de restricción del enzima Hpa I Dianas de restricción del enzima del Apa enzima I Apa I

30 Apa I A1 A2 99 pb 449 pb 57 pb 99 pb 316 pb 133 pb 57 pb A1 A

31 PCR-RFLP C1/C4 C3/C4 C3/C3 C1/C2 C1/C1 C1/C3 C3/C4 C3/C4 C3/C4 C1/C4 C1/C3 C3/C3 C1/C3 C3/C3 C1/C1 605 pb 496 pb 447 pb 158 pb 109 pb 49 pb

32 RAPDs Random Amplified Polymorphic DNAs

33 Técnica RAPDs Consiste en la amplificación mediante PCR de un ADN anónimo, utilizando para ello un cebador de secuencia arbitraria Normalmente se usa un solo cebador, de 10 nucleótidos de longitud y con un contenido alto en G+C Ejemplo: OP-A01 CAGGCCTTCA

34 Programa de PCR para RAPDS 1 ciclo Desnaturalización inicial 94 C 5 min 45 ciclos Amplificación 94 C 30 s Desnaturalización 36 C 1 min Unión cebadores 72 C 1 min Polimerización 1 ciclo Polimerización final 72 C 10 min

35 Amplificación de ADN anónimo con cebadores de secuencia arbitraria

36 Correspondencia entre fragmentos amplificados y bandas en un gel _ +

37 Obtención de RAPDs

38 Origen del polimorfismo de los RAPDs

39 Ventajas de los RAPDs Anónimos: No requieren conocimiento previo del genoma Ensayo rápido, simple y barato Número ilimitado de marcadores Polimorfismo elevado Analizan todo el genoma

40 Desventajas de los RAPDs Herencia dominante Reproducibilidad intra-laboratorio Interpretación de bandas Transferibilidad a otros laboratorios

41 Los RAPDs son marcadores dominantes

42 Reproducibilidad de RAPDs La técnica RAPDs es muy sensible a alteraciones del protocolo Es necesario optimizarlo al comienzo y no cambiarlo Parámetros a controlar: Marca de la ADN polimerasa Cantidad y calidad del ADN Concentraciones en la mezcla de reacción Marca del termociclador Programa de amplificación Condiciones de electroforesis

43 Perfiles de RAPDs obtenidos con dos ADN Polimerasas diferentes

44 RAPDs de variedades de vid (Vitis vinifera L.) Cebador OP-D03

45 RAPDs de variedades de vid (Vitis vinifera L.) Cebador OP-E02

46 RAPDs de variedades de vid (Vitis vinifera L.) Cebador OP-D04

47 Técnicas basadas en la amplificación de fragmentos de ADN anónimo MAAP: Multiple Arbitrary Amplicon Profiling RAPD: Random Amplified Polymorphic DNA AP-PCR: Arbitrary Primed PCR DAF: DNA Amplification Fingerprinting

48 SCARs Sequence Characterized Amplified Regions

49 Obtención de las SCARs 1 2 Clonar el fragmento Amplificar en condiciones restrictivas 1 2 Secuenciar el fragmento Diseñar cebadores específicos

50 Transformación a SCAR OpB OpB OpR01 600

51 Propiedades de las SCARs Análisis sencillo Ensayo más reproducible Transferibles a otros laboratorios Herencia mendeliana codominante (a veces)

52 Técnicas basadas en la amplificación de fragmentos de ADN conocidos STS: Sequence-Tagged Sites SCAR: Sequence Characterised Amplified Region ISSR: Inter-Simple Sequence Repeat CAPS: Cleaved Amplified Polymorphic Sequence STMS: Sequence-Tagged Microsarellite Sites

53 VNTR Número variable de repeticiones en tandem Microsatélites Minisatélites rep. 3 rep. 6 rep.

54 Minisatélites Detección mediante Hibridación Southern

55 Minisatélites

56 STMSs Sequence-Tagged Microsatellite Sites

57 Microsatélites Repeticiones en tándem de secuencias cortas de ADN, de 1 a 10 pares de bases de longitud, para formar secuencias de menos de 150 pb. Ejemplos: (GA) 14, (GAT) 10, (CATC) 8...GAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGA......GATGATGATGATGATGATGATGATGATGAT......CATCCATCCATCCATCCATCCATCCATCCATC... Sinónimos: STMSs, SSRs, STRs

58 ADN genómico Análisis de microsatélites Microsatélite...CAGCCCGTAAATGTATCCATCATTAGCTTTCGATAAAGACCATCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTGTGAAACCCAGTTGAATTAGAATTTTGAATTT......GTCGGGCATTTACATAGGTAGTAATCGAAAGCTATTTCTGGTAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGACACTTTGGGTCAACTTAATCTTAAAACTTAAA...

59 Microsatélites 5...TGACAGTGGGTCACGACTTGAGCCAGTCGTAGCTTGATGATGATGATGATGATGATGATGATGATGATGATGATGATGATGACTCAGTGTGACGCTAGTCGGGTAGTAGCGA ACTGTCACCCAGTGCTGAACTCGGTCAGCATCGAACTACTACTACTACTACTACTACTACTACTACTACTACTACTACTACTGAGTCACACTGCGATCAGCCCATCATCGCT repeticiones 5...TGACAGTGGGTCACGACTTGAGCCAGTCGTAGCTTGATGATGATGATGATGATGATGATGATGATGATGATGATGATGATGACTCAGTGTGACGCTAGTCGGGTAGTAGCGA...3 CTGCGATCAGCCCATCATCG 5 5 GTGGGTCACGACTTGAGCCAG 3...ACTGTCACCCAGTGCTGAACTCGGTCAGCATCGAACTACTACTACTACTACTACTACTACTACTACTACTACTACTACTACTGAGTCACACTGCGATCAGCCCATCATCGCT GTGGGTCACGACTTGAGCCAGTCGTAGCTTGATGATGATGATGATGATGATGATGATGATGATGATGATGATGATGACTCAGTGTGACGCTAGTCGGGTAGTAGC 3 3 CACCCAGTGCTGAACTCGGTCAGCATCGAACTACTACTACTACTACTACTACTACTACTACTACTACTACTACTACTGAGTCACACTGCGATCAGCCCATCATCG pb

60 Obtención de las secuencias flanqueantes Existen secuencias útiles en los bancos de secuencias? NO Utilizar microsatélites como sondas para aislar clones en una genoteca SÍ Identificar secuencias que contengan microsatélites Secuenciar los clones positivos Diseñar cebadores específicos PCR

61 Origen del polimorfismo de los Microsatélites

62 Los Microsatélites son marcadores codominantes

63 Procedimiento básico para los Microsatélites Obtener el material vegetal Extraer el ADN PCR + Electroforesis Determinar el tamaño molecular de los fragmentos Interpretar los resultados

64 Programa de PCR para Microsatélites 1 ciclo Desnaturalización inicial 94 C 5 min ciclos Amplificación 94 C 30 s Desnaturalización C 1 min Unión cebadores 72 C 1 min Polimerización 1 ciclo Polimerización final 72 C 10 min

65 Métodos de separación/detección Agarosa bromuro de etidio Poliacrilamida nitrato de plata

66 Secuenciador Automatico

67 Microsatélites Peso molecular Muestra 1 Muestra 2 Muestra 3 Muestra 4

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69 Peso molecular Muestra 1 Muestra 2 Muestra 3 Muestra 4

70 Equipos de Electroforesis Semiautomática ELECTROFORESIS CAPILAR 1. Exactitud cálculo pesos moleculares 2. Automatización FLUORESCENCIA 1. Experimentos múltiples 2. Sin radiactividad

71 Genotipos de 10 variedades de vid en 6 loci de microsatélites VVS5 VVS29 VVMD7 VVS2 VVS1 VVMD5 Delight Loose Perlette Chasselas apyrene Corinto blanco Graziella I Sultanina Pirovano 166A Sultana moscata Graziella II Basile Logothetis

72 Ventajas de los Microsatélites Polimorfismo muy elevado Número enorme de loci Herencia mendeliana codominante Interpretación sencilla de los resultados Reproducibilidad muy alta Resultados transferibles entre laboratorios Posible automatización

73 Desventajas de los Microsatélites Requiere conocimiento previo del genoma: Inicialmente lentos Inicialmente costosos Coste medio

74 ISSRs Inter Simple Sequence Repeats

75 ISSRs

76 ISSRs

77 REMAP REtrotransposon Microsatellite Amplified Polymorphism

78 REMAP

79 REMAP

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81 AFLP Amplified Fragment Length Polymorphism

82 AFLPs Polimorfismo basado en cambios en dianas de restricción Complicada y cara Gran potencia Repetibilidad No conocimiento previo Marcadores dominantes

83 AFLP Detección radiactiva

84 AFLP Detección fluorescente D D 1 2 D 3

85 AISLAMIENTO DE ADN REACCIONES ENZIMATICAS MUESTRAS ELECTROFORESIS + - GEL RESULTADOS MARCADORES MOLECULARES