Análisis de los microsatélites FGA, D7S820, D5S818 y D16S539 para la identificación de individuos.

Transcripción

1 Clave: Análisis de los microsatélites FGA, D7S820, D5S818 y D16S539 para la identificación de individuos. Olicón-Hernández, Darío Rafael; Jaimes-Díaz, Hueman; Santiago-Hernández, Juan Carlos. DIRECCIÓN DE LOS AUTORES Escuela Nacional de Ciencias Biológicas. Departamento de Bioquímica. Prolongación de Carpio y Plan de Ayala s/n. Col. Santo Tomas. Delegación Miguel Hidalgo, México D.F. CP CORREO ELECTRÓNICO dario_rafael_olicon_hernandez@yahoo.com.mx

2 INTRODUCCIÓN El genoma humano esta constituido por 3.000Mpb y que menos del 1% codifica para la síntesis de proteínas (Pardo, 2001), siendo el resto de las bases lo que caracteriza a cada ser humano dándole su propia huella dactilar. Actualmente el uso de las técnicas de biología molecular basadas en marcadores genéticos son la mejor herramienta para poder identificar indivisos en los casos de homicidio, violación, etc. Los marcadores genéticos son repeticiones idénticas, de uno o varios pares de bases, consecutivas, de secuencias especificas de DNA que puede pertenecer al genoma codificante. El polimorfismo genético hace referencia a la existencia en una población de múltiples alelos de un gen. Es decir, un polimorfismo es una variación en la secuencia de un lugar determinado del DNA entre los individuos de una población. Aquellos polimorfismos que afectan a la secuencia codificante o reguladora y producen cambios importantes en la estructura de la proteína o en el mecanismo de regulación de la expresión, pueden traducirse en diferentes fenotipos. Un polimorfismo puede consistir en la sustitución de una simple base nitrogenada o puede ser más complicado. Los cambios poco frecuentes en la secuencia de bases en el DNA no se llaman polimorfismos, sino mutaciones. (Mckee, 2003). Conforme al aumento del polimorfismo y al número de repeticiones en las secuencias se pueden clasificar en dos grupos principales de marcadores genéticos conocidos como microsatélites y minisatélites, estos forman parte de los marcadores de Secuencias Repetidas en Tandem de Numero Variable o VNTR s por sus siglas en ingles de Variable Number of Tandem Repeats sequences.

3 Los minisatélites se componen de secuencias repetidas de 10 a 30 pb y constituyen segmentos variables de DNA de 0.3 a 50 Kb, su uso fue inicialmente para pruebas de paternidad por DNA fingerprint. La muestra de DNA genómico de cada individuo es digerida con enzimas de restricción, después los fragmentos son separados por tamaño en una electroforesis, transferidos a una membrana e hibridados con sondas que corresponden a la secuencia complementaria del minisatélite (Southern Blot). El producto final del DNA es un patrón de bandas que es específico de un individuo (normalmente entre el 15 al 20% de las bandas son compartidas por dos individuos debido al azar). Las bandas reveladas por esta técnica tienen un patrón de herencia mendeliana, pues en promedio la mitad de las bandas son derivadas de cada progenitor. Los microsatélites, conocidos también como Secuencias Cortas de Repetición en Tandem (STR s por sus siglas en ingles de Short Tandem Repeats), son secuencias repetidas de 2 a 6 pb. Este tipo de marcadores son más polimórficos que los minisatélites y poseen la ventaja que pueden ser analizados por PCR (del ingles Polymerase Chain Reaction). En la amplificación por PCR de los microsatélites, los iniciadores utilizados se ubican en las regiones genómicas que rodean el microsatélite. Por lo tanto, estos marcadores son específicos puesto que las secuencias flanqueantes varían de una especie a otra. La metodología consiste en utilizar iniciadores específicos para amplificar el microsatélite por PCR, realizar una electroforesis en gel de poliacrilamida de las muestras amplificadas y teñir los fragmentos. Los microsatélites muestran un patrón de herencia codominante, es decir siempre se puede identificar los individuos heterocigotos. Los microsatélites se clasifica de acuerdo al número de nucleótidos que posea el motivo de repetición como: di, tri, tetra, penta o hexanucleótido. (Berumen y col 2001 y Mckee 2003). Un buen marcador genético debe reunir una serie de características para maximizar su utilidad, entre ellas, debe tener una buena distribución a lo largo del genoma y alto grado de polimorfismo. La técnica para analizar el marcador debe ser rápida, práctica y debe repetirse con fiabilidad en otros laboratorios (Cheng y Crittenden, 1994).

4 Basados en estudios realizados en esta misma institución se utilizaron los microsatélites D3S1358 y D13S317 y el minisatélite D1S80 (Flores y Briz, 2007) aplicando la misma técnica de análisis para los siguientes microsatélites (Tabla I). TABLA I.- Características des los microsatélites objeto de estudio. Marcador Ubicación Función. Primers FGA 4q28 Codifica la cadena alfa del fibrinógeno humano. D7S820 7q21.11 Genoma no codificante. D16S539 16q24.1 Genoma no codificante D5S818 5q23.2 Genoma no codificante F GCATCCCCATAGGTTCTCA R TGATTTCTGTAATTGCCAGC Acceso a Gen Bank. Tamaño del producto M F TGTCATAGTTTAGAACGAAC G08616 R CTGAGGTATCAAAAACT F GATCCCCTAAACTTCCTCTT R ACGTTTGGTGGCATTGT G F GGTATTTTTTCCTCTTTGGT R TGATTTTCCATCATGCCACA G El presente estudio utiliza cuatro microsatélites para el análisis a partir de las técnicas de biología molecular por ejemplo PCR, electroforesis en gel de agarosa y poliacrilamida para identificar los alelos correspondientes para la identificación de individuos. Se utiliza sangre total como muestra para obtener los leucocitos utilizando el reactivo de Ficoll para la obtención del DNA. Se confirma la existencia de los amplificados y se hace el posterior análisis de los productos de PCR.

5 MATERIALES Y MÉTODOS Obtención de la muestra sanguínea. Para la obtención de la muestra sanguínea se utiliza la Norma Oficial Mexicana NOM-003- SSA2-1993, "Para la disposición de sangre humana y sus componentes con fines terapéuticos". Extracción de leucocitos. Se obtienen los leucocitos de la sangre utilizando el reactivo de Ficoll por densidad de gradientes. (Simizu y col, 2007). Extracción de DNA. A los leucocitos se le agrega la solución de Lisis (TRIS-Cl 10mM, EDTA 100mM, SDS 0.5%) y solución precipitadota de proteínas para la obtención del DNA. Cuantificación y Pureza del DNA. La pureza y cuantificación del DNA se obtiene con el espectro de absorción de las muestras DNA a intervalos de 10nm a partir de 200 hasta 300 nm de longitud de onda. Las siguientes formulas se aplican para obtener los cálculos de integridad del DNA. Pureza = Abs 260/Abs 280 obteniendo rangos entre 1.8 y 2. Cuantificación del DNA [DNA] = 50 µg/ml (Abs 260nm) (Factor de Dilución).

6 Reacción en cadena de la polimerasa (PCR) Utilizando las especificaciones correspondientes a cada marcador reportados en el Centro Nacional de Información Biotecnológica (NCBI). Con las siguientes concentraciones. El proceso se llevo acabo por 30 ciclos (Tabla II) Tabla II.- Preparación de las muestras para PCR. Electroforesis en gel de agarosa. Los productos de amplificación llevados a cabo por la técnica de PCR son sometidos a una electroforesis en gel de agarosa al 0.9% a 80 Volts por 55minutos. Se descargaron 2µl de los productos de PCR de cada uno de los marcadores genéticos.

7 RESULTADOS La cuantificación del DNA y su pureza se cuantificaron con el protocolo ya establecido (Tabla III). Se corroboraron estos resultados al obtener bandas de DNA genómico en una electroforesis en gel de agarosa al 2%. Se analizaron 8 muestras de DNA (Figura 1): TABLA III.- Determinación de pureza y concentración del DNA. Muestra Pureza Concentración (µg/ml) Figura 1.- Gel de agarosa al 2% de DNA genómico. Integridad de ocho muestras de DNA genómico.

8 Al DNA genómico se somete a la técnica de PCR con los iniciadores específicos para cada uno de los marcadores genéticos; posteriormente se analizan en una electroforesis en gel de agarosa al 0.9%. Se muestran que los productos de PCR para los dos microsatélites (D13S317 y D3S1358) y del minisatélite D1S80. (Figura 2, 3 y 4) Figura 2.- Microsatélite D13S317. Amplificado de aproximadamente 199 pb en todas las muestras, con otros alelos no reportados. Figura 3.- Microsatélite D3S1358. Amplificado de aproximadamente 145pb en todas las muestras.

9 Figura 4.- Minisatélite D1S80. Amplificado de aproximadamente 460 pb en todas las muestras.

10 DISCUSIÓN El uso de los microsatélites para poder identificar a los individuos ha tenido un auge muy importante en los últimos años. Como se observan en los resultados se obtienen concentraciones y pureza de DNA y estos marcadores que son aceptables para la identificación de individuos. Es importante recalcar que el cuidado en los puntos críticos tanto de extracción, como de cuantificación y electroforesis deben son vitrales para obtener los máximos rendimientos posibles; como en el caso de que la muestra debe ser tomada en ayunas, que deben ser tratados los tubos con mucha delicadeza para evitar degradación, la temperatura de las soluciones, entre otras. Como se observa en el momento del análisis de las bandas, se denotan líneas que no corresponden a los productos esperados. Esto debido a la presencia de alelos que son variaciones en la presentación del genoma que cuentan con menor o mayor numero de repeticiones en tandem de las que se reportan. Es por esto que los marcadores pueden servir para identificar a poblaciones ya que se considera que un determinado alelo es específico para una determinada población. Entre mas marcadores genéticos sean analizados para una determinada utilidad, en este caso, la identificación de individuos, la prueba tendrá un mayor poder discriminatorio. Es por eso que se recomienda seguir con la estandarización de las condiciones de análisis de los demás marcadores. Se espera que bajo estas mismas condiciones y protocolos, obviamente enfocados a los 4 microsatélites propuestos, se tengan los resultados esperados, como se obtuvo en esta investigación previa.

11 CONCLUSIONES Se obtuvo el DNA de sangre total con la técnica de Ficoll con concentraciones óptimas en el rango de 225 a 2200 µg/ml y una pureza alrededor de 1.6 a El microsatélite D13S317 se encontró un amplificado de 199 pb; así como un amplificado no específico superior a los 200pb (aproximadamente de 230pb) que corresponde a otro alelo con un mayor número de repeticiones en tandem. El microsatélite D3S1358 se encuentra una sola banda de 145 pb, característica de este marcador, falta encontrar las condiciones óptimas para su amplificación. El marcador genético D1S80 es un minisatélite, el tamaño del producto de amplificación reportado es de 430 pb, también se encontraron otros dos alelos inespecíficos y de mayor tamaño de acuerdo al número de repeticiones, aproximadamente de 600 pb para este minisatélite. Las condiciones ya estudiadas para los marcadores genéticos D13S317, D3S1358 y D1S80 se obtuvieron los alelos correspondientes a cada una de las muestras estudiadas de cada marcador; más adelante se estudiarán y analizarán las condiciones optimas para los marcadores genéticos D7S820, D5S818, FGA y el D16S539.

12 REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS 1. J. A. Aranguren-Méndez.. et al. (2005). Microsatellites (STR s), and Molecular Markers for excellency for conservation programs. Arch. Latinoam. Prod. Anim (1): Baumforth, K. R., P. N. Nelson, et al. (1999). "Demystified... the polymerase chain reaction." Mol Pathol 52(1): Cheng, H. H. and L. B. Crittenden (1994). "Microsatellite markers for genetic mapping in the chicken." Poult Sci 73(4): Cushwa, W. T., K. G. Dodds, et al. (1996). "Identification and genetic mapping of random amplified polymorphic DNA (RAPD) markers to the sheep genome." Mamm Genome 7(8): Estivil. X (1993). Proyecto genoma humano. Realidades y esperanzas Med Clin. Bareclona 100 supl 1: Figuera, L. E. and J. M. Cantu (1993). "[The contribution of Latin America to the knowledge of the human genome]." Bol Oficina Sanit Panam 115(1): Flores Vite, J. Estudio de los marcadores genéticos D3S1358 y D13S317 para la elaboración de una huella de paternidad en la población mexicana. TRABAJO DE TESIS CURRICULAR. Diciembre Giovambattista, G., M. V. Ripoli, et al. (2001). "DNA typing in a cattle stealing case." J Forensic Sci 46(6): Hofmann, E. (2001). "What can medicine learn from the human DNA sequence?" Biochemistry (Mosc) 66(10):

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