Clonación de genes de enfermedades humanas Curso de Genética Molecular Ciencias Biológicas Universidad de Jaén

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1 Clonación de genes de enfermedades humanas Curso de Genética Molecular Ciencias Biológicas Universidad de Jaén Antonio Caruz Arcos Dpto. Biología Experimental, Área de Genética Universidad de Jaén

2 Prevalencia aproximada de las enfermedades genéticas en la población general Tipo de enfermedad Prevalencia (1000 nacimientos) Autosómica dominante 3-9,5 Autosómica recesiva 2-2,52,5 Ligada al cromosoma X 0,5-2 Trastornos cromosómicos 6-9 Malformaciones congénitas 20-50

3 Ambiental gripe sarampión enfermedades infecciosas diabetes arteriosclerosis cáncer fibrosis quística hemofilia distrofia muscular Genético

4 12000 Número de enfermedades genéticas descritas en las últimas décadas Autosómica Dominante Autosómica Recesiva Ligada al X Total

5 Estrategias de clonación (I) Clonación funcional Cuando se tiene información bioquímica sobre un rasgo monogénico, es posible en principio diseñar alguna estrategia para seleccionar el gen correspondiente de la genoteca, lo que se ha llamado clonación funcional. Este es el caso del factor VIII de coagulación (hemofilia).

6 Estrategias de clonación (II) Clonación Posicional La clonación funcional no siempre es posible. Cuando, como ocurre con la gran mayoría de enfermedades genéticas, se desconoce la base bioquímica del rasgo, hay que recurrir a otras estrategias, a menudo laboriosas. Como ejemplo, la clonación posicional de genes de enfermedades: consiste en ir estrechando el cerco al gen a partir de su localización cromosómica (genética inversa). La clonación posicional era una estrategia ya empleada antes del PGH.

7 Estrategias de clonación (III) Análisis de genes candidatos Se han aislado muchos genes por clonación posicional, pero la mayoría de ellos sobre la base de mutaciones de deleción, translocación o amplificaciones de trinucleótidos. La clonación posicional a partir de mutaciones puntuales es más ardua, y suele requerir muchos marcadores cercanos al gen y una cartografía fina de desequilibrio de ligamiento. Por ello, se recurre a otra estrategia: enfoque del candidato posicional: se usa información disponible sobre función y posición en el mapa de genes previamente aislados, información que puede proceder de otros proyectos genoma o de ESTs/ADNc.

8 Algunos ejemplos Clonación funcional Clonación posicional Análisis de genes candidatos Talasemia Anemia falciforme Fenilcetonuria Tay-Sachs ADA-SCID Fibrosis quística Distrofia muscular de Duchenne Neurofibromatosis tipo 1 Alzheimer familiar Cloroidemia Gen de la retinitis pigmentosa. Síndrome de Marfan. Cardiomiopatía hipertrófica familiar Atrofia muscular espinal y bulbar Síndrome de Waandenburg Esclerosis lateral amiotrófica.

9 Establecer modo de herencia Defecto determinado por métodos bioquímicos Identificación proteína Clonar el gen Mendeliano Sin pistas bioquímicas Análisis de ligamiento Identificación región cromosómica Complejo Identificar polimorfismos que estén asociados a la enfermedad Estrategia General identificación de genes asociados con enfermedades Gen candidato Diagnóstico Búsqueda mutaciones Probar que la mutación causa la enfermedad Tratamiento

10 Clonación funcional Defecto bioquímico conocido Talasemia Anemia falciforme Fenilcetonuria Tay-Sachs ADA-SCID Aislamiento proteína Proteína purificada y secuenciada, producción de anticuerpos Búsqueda en base de datos Identificación ADNc Búsqueda de mutaciones en individuos afectados

11 Clonación Posicional Defecto desconocido Sin datos cromosómicos Búsqueda de anomalías cromosómicas Distrofia muscular de Duchenne Enfermedad poliquística renal Poliposis de colon familiar Búsqueda de ligamiento (linkage) Encontrar ligamiento a marcador polimórfico Situar el gen lo más precisamente posible preferentemente con menos del 1% de recombinación Situar el gen en un punto concreto de un cromosoma

12 Clonación Posicional

13 Gen localizado en una región cromosómica Clonación mediante Genes candidatos Proyecto genoma humano Predicción de genes a partir de la secuencia en bruto Hay algún gen candidato? NO Tomarse unas vacaciones o alternativamente Buscar exones ocultos SI Elegir un ADNc Modelos animales Buscar todos los exones potenciales en la región (exon trapping, genotecas de sustracción, genómica comparativa Buscar mutaciones individuos afectados

14 Para qué sirve conocer el gen implicado en una enfermedad? Gen mutado identificado Mejor comprensión de la enfermedad Posibilidad de diagnóstico Posible tratamiento En pacientes asintomáticos, sintomáticos o prenatalmente, búsqueda mutación en otros miembros de la familia y consejo genético Terapia convencional más racional Terapia génica y modelos animales para desarrollo de tratamientos Implicaciones en la prognosis, calidad de vida y seguros

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17 Descubrimiento del ligamiento por Bateson y Punnet en cruces con guisantes

18 MAPAS GENÉTICOS Mapas de ligamiento: basados en frecuencias de recombinación (distancias arbitrarias no siempre coincidentes con físicas) Mapas físicos: basados en localizaciones físicas en los cromosomas (pares de bases)

19 LOCI PRESENTES EN EL MISMO CROMOSOMA Productos meióticos Meiosis sin entrecruzamiento entre los genes A A a B B b A A a B B b a b a b Parentales Entrecruzamiento (Crossover): El intercambio de cromátidas no hermanas entre cromosomas homólogos durante la meiosis por un proceso de rotura y reunión del DNA Meiosis con entrecruzamiento entre los genes A A a a B B b b A A a a B b B b 4 Recombinantes

20 MAPAS DE LIGAMIENTO Basados en la frecuencia de recombinación (θ). Los loci en el mismo cromosoma que presentan recombinación menos del 50% de las veces se dice que están ligados. (1 cm = 1% de recombinación). PROBLEMAS: La relación entre θ y distancia física es sólo aproximada ya que los dobles recombinantes no producen recombinación. En humanos las frecuencias de recombinación se obtienen observando la transmisión de alelos en familias.

21 NECESIDAD DE LOS MARCADORES EN MAPAS HUMANOS En humanos raramente se encuentran familias con dos enfermedades hereditarias que segreguen. Por esto se necesitan puntos del genoma independientes denominados marcadores que se transmitan mendelianamente Grupos sanguíneos 20 loci Proteínas séricas 30 loci Alelos HLA 1 haplotipo RFLPs de DNA > 10 5 loci Minisatélites (VNTRs( VNTRs) > 10 4 loci Microsatélites (STRs( STRs) > 10 4 loci SNPs varios millones

22 Nomenclatura de los marcadores

23 MARCADORES MOLECULARES Y ANÁLISIS DE LIGAMIENTO: RFLPs (Restriction Fragment Length Polymorphisms)

24 MARCADORES MOLECULARES Y ANÁLISIS DE LIGAMIENTO: RFLPs

25 VNTRs o MINISATÉLITES (Variable Number of Tandem Repeats)

26 RAPDs: : DNA POLIMÓRFICOS AMPLIFICADOS AL AZAR (Random Arbitrarily Primed DNA)

27

28 Genotipado a gran escala (Applied Biosystems)

29 MAPADO EN HUMANOS: VALORES LOD En un estudio estadístico de ligamiento con un número limitado de individuos se require descartar que los resultados se hayan dado por azar Z x = Probabilidad del resultado observado si θ = x Probabilidad del resultado observado si θ = 1/2 LOD θ = x = log 10 Z x LOD = 3 se toma como evidencia de ligamiento (1000 contra 1, 5% error) LOD = -2 se toma como evidencia de ausencia de ligamiento

30 EJEMPLO DE ASIGNACIÓN DE LOD SCORE CON LA FASE DE TODAS LAS MEIOSIS CONOCIDAS

31 EJEMPLO DE ASIGNACIÓN DE LOD SCORE CON LA FASE DE TODAS LAS MEIOSIS CONOCIDAS

32 Clonación del gen de la fibrosis quística

33 Clonación del gen de la fibrosis quística

34 Clonación del gen de la fibrosis quística

35 Clonación del gen de la fibrosis quística

36 Clonación del gen de la fibrosis quística

37 Distrofia muscular de Duchenne 1 / 3000 niños nacidos (ligado al sexo recesivo) Patient carried a visible deletion of the DNA in the region of the X-Chromosome where Duchenne muscular dystropy had been mapped. Can we use hybridization and cloning to compare his DNA with normal DNA to find the gene responsible for DMD?

38 Clonación del gen de la distrofia muscular de Duchenne

39 Clonación del gen de la distrofia muscular de Duchenne

40 Clonación del gen de la distrofia muscular de Duchenne

41 Clonación del gen de la distrofia muscular de Duchenne Esquema de la proteína Estrategia global

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