El proyecto del genoma humano (PGH)

Transcripción

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2 El proyecto del genoma humano (PGH) Inició en 1990 y fue un esfuerzo coordinado de13 años entre el Departamento de Energía y el Instituto Nacional de Salud. Fue planeado para 15 años pero los avances en secuenciación aceleraron para completarlo en el OBJETIVOS: Identificar los genes del genoma humano Determinar la secuencia nucleotídica de los 3 millones de pares de bases Almacenar la información en Bases de Datos Mejorar las herramientas de análisis de datos Permitir la Transferencia de las tecnologías relacionadas al sector privado Manejar las implicaciones éticas, legales y sociales que surgieran en el proyecto.

3 Cuales son los beneficios prácticos del PGH? Conocimiento acerca de los efectos de las variaciones entre los individuos que dirijan a nuevos métodos revolucionarios para diagnosticar, tratar y algún día prevenir los miles de trastornos que nos afectan. Al mismo tiempo provea claves para el entendimiento de la biología humana, aprendizaje de las secuencias de otros organismos y un entendimiento de sus capacidades naturales que puedan ser aplicadas a la solución de los retos de salud, agricultura, producción energética, bioremediación y el secuestro de carbono.

4 Medidas y Métodos del PGH

5 MAPEO DEL GENOMA

6 MAPA

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8 Bases de Datos de Secuencias PGH

9 Interfases para navegar sobre secuencias genómicas ensambladas

10 Mapas físicos y genéticos Físico: muestra el orden de características a lo largo del cromosoma y su distancia en kilobases o Mb Genéticos: muestran su orden y probabilidad de que se separen mediante recombinación

11 Definición Determinación de la variación del DNA dentro de una especie

12 Recombinantes y no recombinantes La recombinación es un mecanismo que genera Variabilidad Genética Descubrir la frecuencia con que se separan 2 loci

13 Recombinación meiótica Profase I Meiosis I Meiosis II

14 Ligamiento de genes En Cis o trans (según estén combinados los alelos de cada uno de los genes) Si en el cromosoma heredado del padre hay un alelo dominante de un gen y otro dominante del otro gen el ligamiento es en FASE DE ACOPLAMIENTO, por ende en el cromosoma materno si el individuo es heterocigoto estarán los alelos recesivos de ambos genes En cambio cuando en 1 cromosomas hay un alelo dominante y el otro gen está en forma recesiva, y al revés, en el otro cromosoma los genes están ligados en FASE DE REPULSION (trans)

15 Ligamiento de genes P M P M

16 Ligamiento También puede ser TOTAL o PARCIAL dependiendo de que distancia los separe Cuánto más cerca están uno de otro menor es la probabilidad de que suceda un crossing over entre ellos y por lo tanto tienden a heredarse en la misma combinación o haplotipo que poseía el cromosoma materno o paterno A esto se le denomina LIGAMIENTO TOTAL

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19 Si en cambio la distancia que los separa es suficiente para permitir entrecruzamientos entre ellos el ligamiento es PARCIAL

20 Ligamiento parcial Considerar que en algunas células habrá crossing over y recombinación y otras donde no lo haya Por lo tanto el porcentaje de gametos que tienen nuevas combinaciones o RECOMBINANTES siempre es más bajo que el porcentaje de gametos con la combinación original o PARENTAL

21 VNTR s

22 Marcadores genéticos Interés en enfermedades mapa que muestre orden y distancia entre los genes patológicos El mapeo genético requiere heterocigotos dobles Personas heterocigotas para 2 enf diferentes son muy raras Si se encuentran no tienen hijos, no adecuadas para análisis genéticos

23 Marcadores genéticos Marcador: cualquier carácter mendeliano polimórfico que puede utilizarse para seguir un segmento cromosómico a través de una genealogía Útil: que sea fácilmente calificable, material disponible sin gran costo (cel sanguíneas en lugar de biopsia de cerebro!!) Suficientemente polimórfico para que 1 persona seleccionada al azar tenga 1 buena posibilidad de ser heterocigoto

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25 Marcadores polimórficos

26 A Haplotipos: producto de la reproducción sexual en el tiempo A A Muchas generaciones Los cromosomas intercambian fragmentos en cada individuo en cada generación Algunos segmentos son compartidos por varios individuos Los haplotipos son conjuntos de variaciones contenidas en regiones que no han sido interrumpidas por recombinación, es decir, que se han heredado en bloque.

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28 Variabilidad Genómica (Polimorfismos) Un polimorfismo genético se refiere a variaciones genéticas que se presentan en más del 1% de la población SNP: Polimorfismos de un sólo nucleótido ( snips ) Se encuentran aproximadamente 1 cada 350 pb La gran mayoría en regiones no codificantes Un gen contiene en promedio 4 SNP s en su región codificante

29 Desarrollo de marcadores genéticos humanos Tipo de marcador Núm. De loci Características Gpos sanguíneos ( ) 20 Sangre fresca, antisueros raros No siempre posible deducir el genotipo por el fenotipo debido a la dominancia No es fácil la localización física Variantes de movilidad electroforética de proteínas séricas ( ) Tipo de tejido HLA (1970-) 1 (haplotipo) RFLP de DNA (1975-) > Suero fresco, valoraciones especializadas No es fácil la localización física Polimorfismo limitado (potencial mente) Un gpo enlazado. Muy informativo Solo puede estudiar por enlace a 6p marcadores de alelos, heterocigosidad máx de 0.5 Inicial/ requería Southern blotting, hoy PCR Localización física fácil

30 Desarrollo de marcadores genéticos humanos Tipo de marcador Núm. De loci Características NVRT de DNA (minisatélites) (1985-) NVRT de DNA (microsatélites) repeticiones de di-, tri- y tetra nucleótidos(1985-) SNP de DNA (polimorfismos de nucleótido único) >10 4 (potencialmente) Muchos alelos. Muy informativo Southern blotting Localización física fácil Tiende a agruparse cerca de los telómeros >10 5 (potencialmente) Muchos alelos. Muy informativa Tipifica mediante PDR multiplex automatizada Localización física fácil Distribuido en la totalidad del genoma >4 x 10 6 Menos informativo que microsatélites Puede tipificarse a muy grande escala mediante equipo automatizado sin electroforesis en gel NVRT: número variable de repeticiones en tándem

31 Polimorfismos que pueden genotipificarse SNP: polimorfismos 1 sólo nucleótido; se origina x el cambio de 1 nucleótido aislado. Suelen valorarse mediante secuenciación de DNA VNTR (número variable de repeticiones en tándem):surge x inestabilidad en 1 arreglo de repeticiones tándem q causa 1 cambio en el núm de repetición (se emplea + p/minisatélite)

32 Como se originan los polimorfismos

33 Subclases de polimorfismos SNP de sitio de restricción: el cambio en el nucleótido causa pérdida o ganancia de un sitio de restricción. Se tipifica mediante PCR o hibridación Souhtern (RFLP) VNTR microsatélite: polimorfismo de repetición tándem corto (PRCT), o polimorfismo de repetición de secuencia simple (PRSS); repetidos de 1-4 nucleótidos VNTR minisatélite: unidad repetida de 9-65 pb de longitud

34 A/T 1 A A T T Qué son los Tag SNPs? Son SNP s representativos de una región en el genoma, con los cuales, mediante cálculos estadísticos se pueden inferir otros SNP s, que junto con ellos, se heredan en bloque. SNPs marca o tag: G/A 2 G G A A G/C 3 G C G C T/C 4 T C C C G/C 5 G C G C A/C 6 A C C C SNP 1 SNP 3 SNP 6 SNPs inferidos: SNP 2 SNP 4 SNP 5 alta r 2 alta r 2 alta r 2 Carlson et al. (2004) AJHG 74:106 Se analizan solamente 3 SNPs y se obtiene información sobre al menos 6

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36 Clonación posicional Ir estrechando el cerco al gen a partir de su localización cromosómica Se parte de varios pedigrees en la que se ve la segregación del rasgo respecto a múltiples marcadores genéticos polimórficos. En humanos, lo ideal es que la separación entre marcadores no sea mayor de 1cM. Luego, por paseo o salto cromosómico, se va uno acercando al gen. Análisis de genes candidatos Se han aislado muchos genes por clonación posicional, pero la mayoría de ellos sobre la base de mutaciones de delección, translocación o amplificaciones de trinucleótidos. La clonación posicional a partir de mutaciones puntuales es más ardua

37 Mapeo de genes Algunos genes se habían localizado respecto al MODO DE HERENCIA ligado al X, algún FENOTIPO SE HEREDABA EN TANDEM con algún grupo sanguíneo o con un heteromorfismo citogenéticamente detectable.

38 Mapeo físico de genes Asigna a genes localizaciones determinadas a lo largo de un cromosoma Utilizando medidas que son el reflejo de la distancia física entre los genes En unidades de pares de bases Mapeo genético Utiliza un análisis de ligamiento, la medición de la frecuencia con la que dos genes permanecen juntos tras una meiosis cuando pasan de generación en generación.

39 MAPEO FÍSICO DE GENES HUMANOS Cultivo celular Clonas, crecer en algunos de manera indefinida Fibroblastos son la célula más útil, generaciones, senescencia vs transformación. Sangre periférica con transformación blastoide

40 Mapeo por transferencia cromosómica Permite la transferencia de cromosomas enteros o segmentos desde una célula donante hacia una receptora en cultivo Hibridos de cel. Somáticas interespecíficas Heterocariontes Homocariontes Se pierden cromosomas humanos pero no de roedor!!

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42 Mapeo de un gen a una determinada región de un cromosoma Radiación Translocaciones

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44 Medida de la distancia genética Entre una descendencia el 80% de los genotipos son NO RECOMBINANTES (es decir igualito a lo del progenitor, se comportan como si no tuvieran recombinación durante la meiosis) y 20% son RECOMBINANTES

45 Entonces la frecuencia de recombinación, es del 20% A 20 cm un alelo del otro, convirtiendo la fracción de recombinación en una distancia génica. No se realiza observando a una sola familia

46 De verdad DOS LOCI ESTAN LIGADOS? Necesitamos saber si: La fracción de recombinación, es significativamente diferente que 50% (del azar entre dos loci en diferentes cromosomas o simplemente no ligados) Que tan significativa es, se utiliza la razón de probabilidades (likelihoods odds ratio) Los valores de Z mayores a uno sugieren que los loci están ligados. 3 o mayor es una evidencia definitiva de que los loci están ligados Bajo esta fórmula cuando es cero, o sea no hay recombinantes, en los descendientes todos tienen igual que el progenitor, la Z es 1.81

47 Mapas de ligamiento Supongamos que dos loci, A y B, están ligados a una distancia de 10cM. Esta información no es suficiente para construir un mapa, no sabemos el orden Pero si tenemos un locus C y sabemos que este esta a 12 cm de A y a 5cM de B pues tenemos el orden A B C

48 Relación entre distancia genética y distancia física Comparación de parámetros citogenéticos, físicos y genéticos en el genoma Citogenéticos Tamaño físico Distancia génica 23 cromosomas Cromosoma medio Contenido en genes 3*10 9 pb 4300 cm 50, 000! 1.5 * 10 8 pb 200 cm Banda 3 *10 6 pb 5 cm 50

49 Mapeo de genes de enfermedad por análisis de ligamiento Heterogeneidad de locus

50 10cM Tiene que estar a un máximo de 7.5 millones de pb del gen de la enfermedad para que pueda detectarse ligamiento

51 MARCADORES INFORMATIVOS DE ANCESTRIA: Los Marcadores Informativos de Ancestría (AIMS) pueden ser STRs o SNPs, dependiendo de la informatividad de los mismos. Actualmente, con el desarrollo de métodos que permiten determinar simultáneamente SNP s a mediana y gran escala, hacen que sea una estrategia más económica y técnicamente accesible. El criterio para seleccionar los SNP s es que presenten frecuencias alélicas sustancialmente diferentes entre poblaciones bio-geográficas. chrom rs_number alleles CEU YRI CHB JPT AMI chr4 rs A/G chr15 rs A/G chrx rs C/T chrx rs A/G chr18 rs A/G chr4 rs A/G chr17 rs A/G chr18 rs A/G

52 Las Variaciones Genómicas nos hacen miembros individuales de nuestra especie Dan lugar a las características físicas que diferencian a los individuos y a las poblaciones Confieren susceptibilidad o resistencia a enfermedades comunes Modulan la respuesta a tratamientos farmacológicos

53 La información genética contiene información de ancestría (muy importante al aplicar tratamiento farmacológico). Firma Genética. Código de Barra?