Química Biológica Patológica Técnicas de Biología Molecular aplicadas a Bioquímica Clínica
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- Carmelo Franco Casado
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1 Química Biológica Patológica Técnicas de Biología Molecular aplicadas a Bioquímica Clínica Tema1 Dra. Silvia Varas qbpatologica.unsl@gmail.com
2 Tema 1 Genoma Humano Proyecto Genoma Humano Controversias Éticas Mutaciones mas comunes según Human Gene Mutation Database Deleciones y Mutaciones puntuales Estrategias de laboratorio Material usado en un laboratorio de biología molecular
3 Genomahumano Se llama genoma a la totalidad del material genético de un organismo. El genoma humano haploide consiste de 3000 millones pb de DNA El genoma humano tiene unos a genes genes distribuidos en los 23 pares de cromosomas de la célula
4 E.coli Zea may Correlación del tamaño del genoma y número de moléculas ADN genómico Sachoromyces cerevisae Arabidosis thaliana Drosophila melogaster Homo sapiens Mus musculus Tamaño (pb) 4,7x10 6 2,0x10 7 7,0x10 7 1,6x10 8 2,8x10 9 3,3x10 9 1,5x10 10 Moléculas target / µg de ADN genómico 1,8x10 8 4,5X10 7 1,3x10 7 6,6x10 5 3,2x10 5 2,7x10 5 6,0x10 4 µg de ADN que contienen 10 5 moléculas de ADN 0,001= 1ng 0,01= 10 ng 0,01=10ng 0,5=500ng 1 1 2,0
5 ProyectoGenomaHumano El Proyecto Genoma Humano ha identificado la mayoria de los genes presentes en el núcleo de las células humanas y ha establecido la localización que ocupan estos genes en los 23 pares de cromosomas del núcleo.
6 ProyectoGenomaHumano En 1990 se inició oficialmente el proyecto como un programa de quince años con el que se pretendía registrar todos los genes que codifican la información necesaria para construir y mantener la vida. En abril de 2003, científicos del consorcio público completaron el 90% de la secuenciación del genoma humano. Francis Collins (director del ProyectoGenomaHumano) y Craig Venter (gerente de Celera Genomics)
7 El genoma humano es patentable? El 11 de Noviembre de 1997, la UNESCO aprobó la DECLARACIÓN UNIVERSAL SOBRE GENOMA HUMANO Y LOS DERECHOS DEL HOMBRE, fijando tres principios: La dignidad del individuo cualesquiera sean sus características genéticas. Rechazo al determinismo genético. El Genoma Humano es PATRIMONIO DE LA HUMANIDAD.
8 Controversiaséticas El conocimiento del genoma humano tiene también diversas implicaciones éticas, jurídicas y sociales, estimulando un debate internacional sobre algunos aspectos: Patentar secuencias de genes humanos para uso comercial. Confidencialidad en la información obtenida, como por ejemplo, poner la información sobre genética humana a disposición de empresas de seguros. La libertad a no saber si se es o no portador de una enfermedad genética.
9 Espectro de diferentes tipos de mutaciones en genes humanos (Human Gene Mutation Database) Mutaciones sin sentido Mutaciones con cambio de sentido mutaciones en 783 genes
10 Resumen de Mutaciones informadas
11 Mutaciones Puntuales: Sustituciones de una única par de base en genes que causan enfermedades hereditarias
12 DELECIONES DE GENES Las deleciones son responsables de mas 500 enfermedades hereditarias en humanos. Y estas deleciones pueden ser clasificadas en base a la longitud del ADN delecionado. Algunas deleciones consiste de solo unas pocas pares de bases hasta varias cientos de kilobases
13 DELECIONES DE GENES 2,5 a 5% de pacientes con hemofilia A son debidos a deleciones en el gen F8C (Factor VIII) con perdida de 26 exones de un longitud 186 Kb 84% de los pacientes con deficiencia sulfatasa esteroidal (STS), con perdida de 10 exones de una longitud de 146 kb de ADN genómico. Grandes deleciones son comunes en la distrofia muscular de Duchenne, GH, RLDL y el gen de α1-globina
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15 PEQUEÑAS DELECIONES Existe un total de deleciones de genes causantes de enfermedades con una longitud de 20 bp o menos
16 Espectro de diferentes tipos de mutaciones en genes humanos (Human Gene Mutation Database) Mutaciones sin sentido Mutaciones con cambio de sentido mutaciones en 783 genes
17 MUTACIONES PUNTUALES En la región regulatoria En el splicing Sin sentido (nonsense) Con cambio de sentido (missense)
18 Estrategias en el laboratorio de Biología Molecular Grandes Deleciones Mutaciones Puntuales y deleciones pequeñas Southern Blotting Microsatellites and SNPs GAP-PCR MAPH and MLPA Long-range PCR RFLP-PCR(ER-PCR) Mutagenesismediada por PCR Alelo-Específicas: MAS-PCR ARMS- MARMS DOT-ASO
19 Estrategias en el laboratorio de Biología Molecular II Desconozco la mutación o polimorfismo SSCP (single strand conformation polymorphism) DGGE (Denaturing Gradient Gel Electrophoresis)
20 SSCP SSCP (single strand conformation polymorphism) es un método simple y accesible para detectar alteraciones en la secuencia en un fragmento obtenido por PCR
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22 DGGE (Denaturing Gradient Gel Electrophoresis) simple complejo Los productos de PCR son cargados en un gel con un gradiente desnaturalizante 20% Típicamente 20-80% formamida ADN doble cadena migra hasta encontrar su melting El meltinges determinado por su secuencia y contenido de GC 80% Las diferentes secuencias migran a diferentes distancias
23 DESNATURALIZACIÓN DEL DNA 1. Composición de bases 2. Longitud DNA doble 3. Presencia de agentes desnaturalizantes Agentes desnaturalizantes. Formamida: Baja la T de melting a 0,72 C cada 1%
24 DGGE (Denaturing Gradient Gel Electrophoresis) II Ventajas Puedo cortar las bandas y secuenciar Puedo detectar pequeñas diferencias en la secuencia de DNA Desventajas Puede haber complejidad en el chorreado de las muestras Requiere una aparatología específica
25 Elementos de Laboratorio
26 TUBOS EPPENDORF 200 µl 500 µl 1,5ml
27 Pipetas Automáticas P-1000 P-200 P-100 P µl µl µl 0,5-10 µl
28 Termocicladores
29 Sembrar por Inmersion Well vacios
30 Fuente de Poder Cuba de Electroforesis Horizontal
31 Cuba Vertical para geles de Poliacrilamida
32 Cuba Vertical para geles de Poliacrilamida
33 PROTECCION
34 Bibliografía Eric D. Green: The Human Genome Project and Its Impact on the Study of Human Disease StylianosE. Antonarakis, Michael Krawczak, David N. Cooper: The Nature and Mechanisms of Human Gene Mutation
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