TEMA 10: DIAGNÓSTICO DE ENFERMEDADES GENÉTICAS 1

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1 TEMA 10: DIAGNÓSTICO DE ENFERMEDADES GENÉTICAS 1 Tema 10. Diagnóstico de enfermedades genéticas Estrategias generales de diagnóstico de enfermedades genéticas. Métodos de detección de mutaciones. Aplicación del ligamiento genético al diagnóstico de enfermedades genéticas. Genética forense. Estrategias generales de diagnóstico de enfermedades genéticas Como en cualquier otro tipo de patologías, el diagnóstico de enfermedades genéticas se realiza mediante la identificación clínica de los síntomas y signos que caracterizan cada síndrome concreto, apoyado en datos de laboratorio. Con los avances del Proyecto Genoma Humano, hoy en día es posible, en muchos casos, analizar directamente la alteración causal a nivel del ADN. De todas formas, en el entorno clínico nos encontramos varios problemas que pueden dificultar el diagnóstico correcto. En primer lugar, la posible presencia de heterogeneidad genética: varios genes pueden ser los responsables de una única enfermedad. Esta circunstancia hace muy laborioso el estudio mutacional, ya que multiplica el número de exones que hay que analizar. Incluso en aquellos casos en los que se sabe con exactitud cuál gen está alterado, puede suceder que las mutaciones responsables del cuadro clínico se distribuyan por todo el gen (fenómeno que algunos autores denominan heterogeneidad alélica), de manera que sería necesario analizar toda la región codificante antes de poder descartar o confirmar que el gen en cuestión está mutado. Lógicamente, si se trata de un gen de gran tamaño, el análisis se hace extremadamente laborioso. La situación opuesta vendría dada por aquellas enfermedades genéticas que están causadas, en la gran mayoría de familias, por una misma mutación, de manera que podemos centrarnos en el estudio de esa mutación concreta para confirmar o descartar el defecto molecular que provoca esa enfermedad. Por tanto, hemos de sopesar todas las circunstancias mencionadas para decidir si nos inclinamos por realizar lo que se denomina diagnóstico directo (análisis de un individuo para ver si es portador de la mutación concreta que causa la enfermedad en esa familia), o si por el contrario aplicaremos el denominado diagnóstico indirecto (análisis de marcadores genéticos en la familia para ver si el consultando ha heredado el cromosoma que lleva la mutación). A continuación discutiremos las ventajas e inconvenientes de cada una de estas aproximaciones diagnósticas, así como los métodos más habitualmente empleados. El video de la Figura 10.1 explica las dos estrategias diagnósticas para detectar alteraciones genéticas en enfermedades humanas. Métodos de detección de mutaciones Como hemos dicho, el diagnóstico directo consiste en el estudio de un gen cuya implicación en el desarrollo de una enfermedad ya ha sido demostrada para detectar la presencia de posibles mutaciones en el mismo. En aquellos casos en que las mutaciones patogénicas pueden estar localizadas a lo largo de toda la secuencia codificante del gen (heterogeneidad alélica fuerte), se deben utilizar métodos "de barrido", que examinan cada exón por separado para detectar simplemente si existe una mutación o no. Estos métodos no identifican el tipo de mutación, pero nos permiten descartar rápidamente todos aquellos exones normales, para centrarnos en el estudio de los exones mutados. En cambio, cuando queremos detectar una mutación concreta, porque ya sabemos que es ésta mutación la que origina la enfermedad en esta familia, utilizaremos métodos dirigidos a identificar únicamente esa

2 TEMA 10: DIAGNÓSTICO DE ENFERMEDADES GENÉTICAS 2 mutación (métodos "de confirmación"). Éstos últimos son quizás los métodos más utilizados en el contexto de un laboratorio diagnóstico, especialmente en aquellas enfermedades que tienen una heterogeneidad alélica limitada, es decir, enfermedades en las que un pequeño número de mutaciones causan la inmensa mayoría de los casos. Los ejemplos más notorios son la mutación C282Y (que causa la mayoría de los casos de Hemocromatosis Hereditaria en europeos); la inversión de los exones 1-22 del gen del Factor VIII de la coagulación (responsable de un 50% de los casos de hemofilia A); la mutación G380R del gen FGFR3 (que causa la mayoría de los casos de Acondroplasia), las mutaciones N370S y L444P (que detectan la mayoría de los casos de Enfermedad de Gaucher), o las enfermedades por expansión de trinucleótidos (Enfermedad de Huntington, Síndrome del X Frágil, etc). En otras enfermedades se puede optar por diagnóstico directo o indirecto, como por ejemplo el caso de la Fibrosis Quística del páncreas, causada por mutaciones en el gen CFTR. Una mutación (F508del) es la causa de la enfermedad en hasta un 80% de pacientes de origen nor-europeo, lo cual permitiría la detección directa de esta mutación. En otras zonas geográficas, en cambio, esta mutación no es tan prevalente y habría que buscar a lo largo de todo el gen, lo cual aconsejaría hacer diagnóstico indirecto. A continuación analizaremos algunos de los métodos más utilizados en el diagnóstico directo, tanto métodos de barrido como de confirmación. 1. MÉTODOS DE BARRIDO para la detección rápida de mutaciones (sin identificar el tipo concreto de mutación). Excepto en el primero (SSCP) estos métodos se basan en la detección de heteroduplexes, que se forman por la reasociación lenta de las cadenas tras la desnaturalización del fragmento de ADN. Cuando el fragmento contiene una mutación y se mezcla con un ADN normal, la desnaturalizaciónreasociación da lugar a moléculas heteroduplex portadoras de un desemparejamiento (mismatch) precisamente en el nucleótido donde está la mutación. SSCP (Single Strand Conformation Polymorphism, Polimorfismo de la Conformación de Cadenas Sencillas). Un cambio en la secuencia provoca cambios conformacionales cuando el ADN se desnaturaliza (se separan las dos cadenas) y se deja que cada cadena se repliegue por separado. Estos cambios conformacionales se detectan porque alteran la migración electroforética en geles de poliacrilamida no-desnaturalizantes. En el ejemplo típico, se amplifica un exón mediante PCR, se desnaturaliza el producto de PCR por calor, se cargan los productos desnaturalizados en un gel de acrilamida, se realiza la electroforesis y se tiñe el gel mediante una tinción específica para el ADN (tinción de plata, por ejemplo). Si no hay mutaciones, se detectarán únicamente las bandas correspondientes al homodúplex (resultado de la reasociación parcial de las dos cadenas complementarias durante la electroforesis) y las bandas correspondientes a cada una de las cadenas sencillas que se han replegado adoptando una conformación determinada. En cambio, la presencia de una mutación dará lugar a nuevas bandas debidas al patrón de plegamiento de las cadenas sencillas mutantes, que será diferente al de las cadenas nativas. Como hemos comentado, este análisis no nos dice de qué tipo de mutación se trata: para eso es necesario secuenciar este producto de PCR y compararlo con la secuencia normal. La ventaja es que nos permite descartar la presencia de mutaciones rápidamente, lo que ahorra tiempo y recursos. Figura 10.2 Video que explica gráficamente la técnica de SSCP. DGGE (Denaturing Gradient Gel Electrophoresis, Electroforesis en Gel con Gradiente Desnaturalizante) y sus variantes, entre las que destaca TGGE (Temperatura Gradient Gel Electrophoresis). Esta técnica se basa en someter una muestra de ADN a una electroforesis en geles de acrilamida con un gradiente desnaturalizante químico o térmico, de manera que la muestra se encuentra con condiciones cada vez más desnaturalizantes a medida que avanza por el gel. Las muestras de ADN son productos de PCR (exones, habitualmente) en cuyo extremo hay una región corta muy rica en citosinas y guaninas (región llamada "clamp" o "pinza" GC), de forma que la

3 TEMA 10: DIAGNÓSTICO DE ENFERMEDADES GENÉTICAS 3 temperatura de desnaturalización de esta pequeña región es mayor que la del resto del fragmento. Por tanto, cuando el fragmento va avanzando por el gel, llegará un momento en que se desnaturaliza todo excepto la región del clamp-gc. El resultado es que el fragmento se frena y deja de avanzar por el gel. Cuando la muestra de ADN es un heteroduplex que contiene un desemparejamiento, su punto de desnaturalización será distinto al del fragmento nativo, y por tanto se parará en un punto distinto del gel. Esto se reflejará en la aparición de una banda con distinta migración electroforética. La Figura 10.3 ilustra el fundamento de las técnicas que detectan la presencia de heterodúplex, con ejemplos de DGGE y TGGE. DHPLC (Denaturing HPLC) es una técnica en la que los heteroduplex y homoduplex son separados en un aparato de HPLC (High Performance Liquid Chromatography) utilizando un gradiente desnaturalizante de acetonitrilo y variando la temperatura de la columna. La muestra se injecta en una columna de cromatografía y el ADN se une a la matriz. El acetonitrilo deshace estas interacciones y el ADN eluido se detecta a la salida de la columna midiendo la absorbancia a 260 nm, originando un pico a un tiempo de elución característico. En temperaturas bajas, no desnaturalizantes, la concentración de acetonitrilo necesaria para eluir un fragmento depende del tamaño y la secuencia del mismo, por lo que cada fragmento da lugar a un pico de elución característico. Al aumentar la temperatura de la columna, la elución tiene lugar a concentraciones menores de acetonitrilo, a medida que el fragmento comienza a desnaturalizarse. Como los heteroduplex se desnaturalizan a temperaturas distintas a los homoduplex, generan picos a tiempos de elución diferentes. De este modo es posible detectar mutaciones puntuales. La gran ventaja del DHPLC es su rapidez, ya que los tiempos de elución típicos están en torno a los 5 minutos y una muestra se puede analizar en 10 minutos. Por tanto, conserva la gran sensibilidad de los métodos de detección de heteroduplex que utilizan un gradiente desnaturalizante (temperatura, en este caso), pero tiene una procesividad mucho mayor y es fácilmente automatizable. La figura 10.4 presenta ejemplos del análisis mediante DHPLC. En la imagen se puede ver el análisis de dos muestras (una muestra normal y una muestra con una mutación) del exón 12 del gen JAK2, analizadas a dos temperaturas distintas. Tanto a 56ºC como a 56,4ºC se puede distinguir la muestra normal de la muestra que lleva la mutación, que presenta dos pequeños picos antes del pico principal. Los picos

4 TEMA 10: DIAGNÓSTICO DE ENFERMEDADES GENÉTICAS 4 pequeños corresponden a los heterodúplex, y sólo aparecen si en el ADN original hay una mutación. Rotura de Desemparejamientos (Mismatch Cleavage). Es un método basado en el hecho de que determinados tratamientos químicos o enzimáticos son capaces de romper un fragmento de ADN específicamente en el punto donde existe un desemparejamiento. Como hemos dicho, los heteroduplexes son portadores de un desemparejamiento (mismatch) precisamente en el nucleótido donde está la mutación. Por tanto, el tratamiento con determinadas sustancias romperá el fragmento sólo en el caso de que existan desemparejamientos, de forma que una electroforesis en gel será suficiente para comprobar la presencia de una mutación. PTT (Protein Truncation Test, Prueba de truncamiento de proteínas). Es un método especialmente dirigido a la detección de mutaciones que crean un codón de parada prematuro y provocan el truncamiento de la proteína. Para llevar a cabo esta prueba, se prepara ADNc mediante RT-PCR (PCR tras transcripción reversa del ARN del paciente) utilizando un cebador que contiene la secuencia del promotor del fago T7 y la secuencia consenso de inicio de la traducción (secuencia de Kozak). Esta construcción permite realizar la transcripción y traducción in vitro, a partir del producto de la RT-PCR. El análisis en un gel de acrilamida de los fragmentos proteicos que resultan de la transcripción/traducción revelará la presencia de una banda correspondiente al tamaño esperado para la secuencia nativa, o bien otras bandas de menor tamaño correspondientes a todas las posibles mutaciones que provoquen un truncamiento del producto proteico (mutaciones sin sentido, los cambios del marco de lectura y las mutaciones que afectan a las secuencias de ayuste). La figura 10.5 ilustra el fundamento de la técnica de PTT. Secuenciación. Hoy en día, con la aparición de equipos fluorescentes automatizados y con bajo coste por reacción, la secuenciación directa de productos de PCR (exones, o incluso la secuenciación directa de un ADNc obtenido por RT-PCR) es un método cada vez más popular de detección de mutaciones. Tiene la ventaja de que identifica el tipo de mutación, y de hecho es un paso obligado para identificar las mutaciones detectadas por los métodos de barrido que acabamos de explicar. Sin embargo, sólo es realmente fiable cuando el ADN mutado está en una proporción superior al 15-20% del total de ADN presente en la muestra. Aunque esto se cumple en las enfermedades hereditarias, no es así cuando se trabaja con muestras procedentes de tumores, en las que con frecuencia la cantidad de células tumorales es baja y no todas son portadoras de una mutación concreta (por lo que el número de moléculas mutadas puede ser inferior al 15% del total).

5 TEMA 10: DIAGNÓSTICO DE ENFERMEDADES GENÉTICAS 5 La figura 10.6 muestra una mutación detectada mediante secuenciación en el nucleótido 97 de este fragmento, cuya secuencia normal se representa en el electroferograma superior. Debajo de él vemos la secuenciación de una muestra de un paciente, con dos picos (correspondientes a timina y citosina) en esa posición. La herramienta informática detecta automáticamente este tipo de alteraciones y nos alerta sobre la presencia de una posible mutación (figura inferior). Cada uno de los métodos de barrido que hemos visto tiene sus ventajas e inconvenientes, sobre todo en lo referente a la sensibilidad (porcentaje de mutaciones que son capaces de detectar), coste, complejidad técnica, capacidad de especificar la posición de la mutación, etc. Aunque las características de cada método se presentan resumidas en la siguiente tabla, la elección de un método u otro dependerá de las peculiaridades de cada laboratorio, del gen que se quiera estudiar, los medios disponibles y la experiencia previa con cada uno de los métodos. MÉTODO VENTAJAS INCONVENIENTES Secuenciación Detecta todas y especifica la posición. Excesiva información, coste alto, laboriosa. SSCP DGGE y DHPLC Rotura de Desemparejamientos PTT Sencillo. Buena sensibilidad. Muy alta sensibilidad. Muy alta sensibilidad. Puede especificar posición. Alta sensibilidad. Especifica la posición. Secuencias <400bp. No especifica posición. Cierta complejidad. No especifica posición. Gran dificultad técnica. Toxicidad OsO 4. No todos los tipos de mutaciones. Complejidad técnica, coste.

6 TEMA 10: DIAGNÓSTICO DE ENFERMEDADES GENÉTICAS 6 2. MÉTODOS DE COMPROBACIÓN para detectar de la existencia de una mutación específica: PCR-Digestión. El fundamento de esta técnica reside en el hecho de que la mutación crea o destruye una diana de restricción, de modo que la simple digestión del producto de PCR con el enzima de restricción permite determinar, en un gel de agarosa, el patrón de digestión indicativo de la presencia o ausencia de la mutación. Es un método que, por su sencillez y rapidez, es uno de los más utilizados en laboratorios clínicos. La principal limitación, lógicamente, es que no todas las mutaciones alteran una diana de restricción. La figura 10.7 explica el proceso de detección de una mutación específica mediante la digestión de un producto de PCR con enzimas de restricción. ASO (Allele Specific Oligonucleotide, Oligonucleótido Especifico de Alelo). Una técnica bastante utilizada en los primeros años del diagnóstico molecular, aunque hoy en día ha caído en cierto desuso. Se basa en el diseño de sondas específicas para el alelo mutado y para el alelo nativo, utilizando oligonucleótidos. El tamaño de las sondas hace que su Tm (temperatura de desnaturalización) sea lo suficientemente distinta para que en determinadas condiciones de hibridación la sonda específica del alelo normal hibride solamente con ADN normal, y la sonda específica del alelo mutado hibride específicamente con ADN genómico que contiene la mutación. El ADN de los pacientes (puede ser tanto ADN genómico como un exón amplificado mediante PCR) se deposita en membranas de nylon haciendo un "dot-blot", y esas membranas se hibridan con cada una de las sondas (oligonucleótidos marcados con radioactividad o con fluorescencia). El análisis de la hibridación de cada sonda permite identificar si la muestra contiene un solo alelo mutado (heterocigoto), dos alelos mutados (homocigoto para la mutación), o ninguno (homocigoto sano). ARMS (Amplification Refractory Mutation System, Sistema de Mutación Resistente a la Amplificación) está basada en el mismo principio que ASO, es decir, la utilización de oligonucleótidos específicos para la secuencia normal y para la secuencia mutada. La diferencia estriba en que, en el caso del ARMS, estos oligonucleótidos son cebadores de PCR. Se diseñan, por tanto, dos reacciones de PCR que comparten un mismo cebador común pero se diferencian en los cebadores específicos para cada alelo: un cebador amplificará sólo el alelo normal, el otro cebador amplificará sólo el alelo mutado. Dada la rapidez y sencillez de la PCR, esta técnica está desplazando cada vez más a la técnica de ASO. MLPA (Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification) es un método que permite determinar el número de copias de hasta 45 genes en un solo ensayo, pudiendo discriminar secuencias que difieren en un solo nucleótido. MLPA utiliza, para cada gen, dos sondas: una de ellas es complementaria a la secuencia que se quiere estudiar (21-30 nucleótidos), y se le añade en el extremo 5' la secuencia de un cebador universal; la otra sonda de la pareja tiene otra secuencia complementaria a la región, unida a un ADN de relleno que puede ser de distintos tamaños y lleva la secuencia de otro cebador universal en el extremo 3'. Ambas sondas hibridan a ambos lados de la región que queremos analizar, y son ligadas por una ligasa termoestable. Con un solo cebador se pueden amplificar las sondas que se han ligado correctamente. Utilizando secuencias de relleno de distintos tamaños para cada gen, podemos amplificar en una misma reacción muchos fragmentos distintos, lo que ahorra mucho tiempo y reactivos. Además, como las condiciones de reacción son las mismas, la cantidad final de producto es proporcional a la cantidad inicial de ADN, por lo que los resultados de MLPA pueden ser cuantificados. Por tanto, MLPA permite detectar deleciones y amplificaciones, además de detectar mutaciones.

7 TEMA 10: DIAGNÓSTICO DE ENFERMEDADES GENÉTICAS 7 La Figura 10.8 resume los principios generales de varios métodos para la detección de mutaciones específicas, basados en la utilización de oligonucleótidos específicos. Un comentario final a todas estas técnicas de análisis directo es que pueden aplicarse a ADN procedente de distintos tipos de muestra, ya que trabajan con secuencias amplificadas mediante PCR. Por tanto, es posible detectar la presencia de mutaciones no sólo en ADN de sangre periférica, sino también en raspados bucales, vellosidades coriales, cabello, biopsias, material incluido en bloques de parafina o incluso de tarjetas impregnadas con manchas de sangre (tarjetas de Guthrie, por ejemplo). El proceso de diagnóstico indirecto de enfermedades genéticas. Como ya se ha mencionado al principio de este capítulo, hay ocasiones en las que no es posible, o resulta muy poco práctico, llevar a cabo diagnóstico directo. Esto sucede en aquellos casos en los que no se conoce la secuencia del gen causante de una enfermedad, o cuando éste es excesivamente grande y complejo (compuesto por muchos exones, por ejemplo). En estos casos todavía podemos predecir si un individuo ha heredado la enfermedad, estudiando marcadores específicos que nos permitan identificar cuál cromosoma de los progenitores es el que lleva la mutación. Una vez identificado, simplemente hemos de ver qué cromosomas han heredado los hijos, para predecir la probabilidad de que también hayan heredado la mutación. Como no estudiamos directamente el gen, sino marcadores genéticos que nos ayudan a identificar los cromosomas, se denomina a este proceso "Diagnóstico Indirecto". Para comprender el diagnóstico indirecto es necesario repasar los conceptos generales de ligamiento genético y su aplicación a familias humanas que han sido expuestos en el Tema 4. A veces nos enfrentamos con una enfermedad genética cuyo gen causal no ha sido todavía identificado, lo que obviamente impide realizar diagnóstico directo. En otras ocasiones, aún conociendo el gen que debe estar mutado, resulta impracticable realizar estudios de diagnóstico directo en la rutina de un laboratorio clínico, por la gran heterogeneidad alélica que muestra esa enfermedad (un gran número de posibles mutaciones pueden ser las responsables del cuadro clínico), o en genes con una estructura exónica muy compleja. Un ejemplo bastante claro es la Distrofia Muscular de Duchenne (DMD), debida a mutaciones en el gen de la distrofina. Este gen es muy grande (ARNm de 14 kb) y tiene 79 exones distribuidos a lo largo de 2,3 Megabases de ADN genómico, por lo que el estudio mutacional de cada exón sería excesivamente laborioso. En este tipo de situaciones, una alternativa muy utilizada es la de establecer si el probando ha heredado el cromosoma o los cromosomas parentales que llevan el gen mutado, o si por el contrario ha heredado los cromosomas parentales normales. Para hacer esto se sigue un proceso denominado "gene tracking", algo así como "seguir la pista" a los alelos enfermos en una familia concreta. Esto se hace utilizando marcadores polimórficos situados muy cerca o incluso dentro del gen en cuestión, escogiendo aquellos marcadores que sean informativos en cada familia concreta. Los marcadores son del mismo tipo que los utilizados en el análisis de ligamiento (RFLP, microsatélites). Utilizando esta estrategia podemos saber si un individuo ha heredado una mutación de su progenitor enfermo simplemente determinando si ha heredado el cromosoma mutado de ese progenitor. Lógicamente, esta estrategia es válida siempre que no haya habido ninguna recombinación entre el locus de la enfermedad y el locus del marcador, de ahí que utilicemos marcadores tan cercanos al gen que la frecuencia de recombinación sea prácticamente cero. De hecho, la metodología empleada es la misma que en los estudios de ligamiento, pero varía la manera de utilizar la información obtenida: mientras en los estudios de ligamiento queremos determinar la distancia entre dos loci, en el análisis indirecto ya sabemos cuál es esa distancia (y conocemos por tanto la frecuencia de recombinación) y

8 TEMA 10: DIAGNÓSTICO DE ENFERMEDADES GENÉTICAS 8 simplemente utilizamos esa información para determinar cuál cromosoma ha sido transmitido por cada progenitor a un individuo concreto de la descendencia. El proceso general que se sigue en el diagnóstico indirecto es el siguiente: a) distinguir los dos cromosomas en cada uno de los progenitores: para esto es imprescindible encontrar un marcador para el que ambos progenitores sean heterocigotos (a poder ser no idénticos), de manera que esta familia sea totalmente informativa. b) resolver la fase de ligamiento en el individuo transmisor: esto supone ser capaces de determinar cuál de los alelos del marcador segrega con el alelo de la enfermedad (y "viaja", por tanto, en el mismo cromosoma). Para esto hay que estudiar a los progenitores del individuo transmisor o a su descendencia y deducir la fase de ligamiento entre el marcador y el gen. Nuevamente, una recombinación entre ambos loci (enfermedad y marcador) llevaría a resultados erróneos, de ahí la importancia de usar marcadores cercanos al gen (o intragénicos) de modo que la frecuencia de recombinación entre ambos sea despreciable. c) Determinar el alelo del marcador que ha sido transmitido al probando. Esto nos dirá (con una fiabilidad mayor o menor dependiendo de la fracción de recombinación entre el marcador y el gen) si se ha transmitido el cromosoma con el alelo mutado o el alelo normal. Aquí se hace evidente la enorme utilidad del diagnóstico indirecto: permite establecer si un individuo ha heredado la mutación sin necesidad de detectar directamente la presencia de la misma. Como hemos comentado, su gran limitación viene dada porque en ocasiones los marcadores están a cierta distancia del locus de la enfermedad y las predicciones no son fiables al 100%. Por ejemplo, si la distancia entre el marcador y el locus de la enfermedad fuese de 5 cm (lo que supone una frecuencia de recombinación del 5%), la fiabilidad del análisis sólo sería del 95%, ya que en un 5% de los casos podría haberse dado un sobrecruzamiento entre ambos loci que hubiese trasladado el alelo mutado al cromosoma homólogo. En la práctica, solventamos esta limitación mediante el uso de varios marcadores, preferiblemente situados a ambos extremos del locus de la enfermedad. De esta forma, la única posibilidad de error sería un doble sobrecruzamiento entre el locus de la enfermedad con cada uno de los marcadores, pero la probabilidad de que esto suceda es prácticamente despreciable. Lógicamente, a mayor número de marcadores, mayor fiabilidad de los resultados, sobre todo si además se incluyen marcadores situados dentro del propio gen de la enfermedad. La Figura 10.9 explica, mediante un video, el proceso general del diagnóstico indirecto utilizando marcadores polimórficos en ligamiento con el gen responsable de una enfermedad genética. Genética forense Los polimorfismos del ADN que se han estudiado en el Tema 1 tienen una aplicación práctica muy concreta: como son únicos para cada persona, pueden utilizarse para identificar un muestra biológica como perteneciente a un individuo concreto. Desde que Alec Jeffreys desarrolló el concepto de huella dactilar genética (genetic fingerprint), el análisis de polimorfismos se ha convertido en una herramienta esencial en medicina legal y forense: pruebas de paternidad, identificación del culpable de un crimen, identificación de restos humanos, etc. En 1985, Alec Jeffreys descubrió sondas de ADN que hibridaban con minisatélites distribuidos en varios loci por el genoma humano (conocidos también como VNTR: Variable Number of Tandem Repeats). Aunque utilizaba un sonda frente a un VNTR del gen de la mioglobina que no es polimórfico, al hibridar

9 TEMA 10: DIAGNÓSTICO DE ENFERMEDADES GENÉTICAS 9 mediante Southern blot en condiciones poco restrictivas la sonda se unía a otros minisatélites que sí son polimórficos en la secuencia GGAGGTGGGCAGGARG. Esto llevó al desarrollo de sondas multilocus, que dan patrones de bandas complejos y únicos para cada individuo. El problema del Southern blot es que requiere grandes cantidades de ADN, por lo que no puede utilizarse en algunos escenarios forenses en los que sólo se cuenta con una pequeña muestra (un pelo, saliva, etc). La llegada y popularización de la técnica de PCR a finales de los años 80 hizo posible estudiar pequeñas cantidades de ADN, pero no es aplicable a los minisatélites debido a su gran tamaño. Por ello, se introdujo el análisis de otro tipo de polimorfismos, los microsatélites (también llamados STR: Short Tandem Repeats). Se trata de marcadores de un solo locus, pero la combinación de un número relativamente bajo de microsatélites (entre 10 y 15) permite llegar a niveles de confianza muy altos cuando se comparan dos muestras de ADN. Figura Análisis de VNTR en muestras de ADN de una mancha de sangre y de varios sospechosos. El módulo Human Identification de esta animación muestra todo el proceso de análisis de microsatélites utilizado en medicina legal y forense. Es muy importante comprender cómo se establece la fiabilidad de esta tecnología. En primer lugar, la comparación de perfiles de ADN permite excluir que dos muestras sean idénticas, y por tanto se puede decir con total certeza que un individuo no ha dado lugar a la muestra obtenida en la escena del crimen, por ejemplo. En cambio, nunca se puede decir con total certeza que el sospechoso sea culpable aunque los perfiles genéticos de ambas muestras sean idénticos, porque existe la posibilidad de que otra persona (en el mundo, o en ese país) tenga ese mismo perfil genético. Por tanto, esto debe expresarse siembre como la probabilidad de encontrar otra persona (distinta del sospechoso) con ese mismo perfil genético. Es decir, lo que se trata de establecer es la probabilidad de que el acusado sea inocente a pesar de que su perfil genético coincida con el obtenido en la escena del crimen. Es muy importante comprender que no se trata de establecer la probabilidad de que el perfil genético del sospechoso coincida con la muestra, si es inocente. Esta confusión, conocida como la falacia del fiscal ya que puede confundir a un jurado, puede explicarse con el siguiente ejemplo. Un determinado perfil genético (una combinación de varios microsatélites) tiene una determinada probabilidad en una población concreta, dependiendo de las frecuencias alélicas de esos polimorfismos en esa población. Esa probabilidad se calcula como se ha explicado en la Figura Suponiendo que dicha probabilidad es 1 en 10 6, un fiscal podría intentar convencer al jurado de que un sospechoso con ese perfil genético tiene una probabilidad de una en un millón de ser inocente, pero esto no es así. Si en esa población hay, por ejemplo, 20 millones de posibles culpables, resulta que podríamos encontrar por azar 20 individuos con ese mismo perfil genético, de los cuales obviamente sólo uno puede ser el culpable. Por tanto, la probabilidad real de que el sospechoso sea culpable es de 1 por cada 20 incluso cuando su perfil genético coincide con la muestra obtenida en la escena del crimen. Dicho de otro modo, tiene una probabilidad de 19 sobre 20 de ser inocente aunque su perfil genético coincida con el

10 TEMA 10: DIAGNÓSTICO DE ENFERMEDADES GENÉTICAS 10 obtenido en la escena del crimen. En cualquier caso, hoy en día se obtienen perfiles con probabilidades de aparición por azar muy bajas (en torno a ), por lo que resultan muy fiables. Los perfiles genéticos también pueden utilizarse para la identificación de restos humanos y establecer su parentesco con otros restos o con personas vivas. En estos casos suelen utilizarse polimorfismos del cromosoma Y o del ADN mitocondrial, por la razón de que se heredan exclusivamente por vía paterna (el cromosoma Y) o materna (el ADN mitocondrial). El caso más conocido es el estudio de los restos de la familia real rusa que aparecieron en una fosa en Siberia, y el juicio que se desarrolló en Alemania en torno a la identidad de una mujer que decía ser Anastasia, la hija perdida del zar asesinado. Años después, el estudio de los restos óseos, comparando su ADN mitocondrial con el de miembros vivos de otra casa real que compartían un ancestro femenino, demostró que esa mujer no podía haber sido la hija de Nicolás II. Figura El módulo Recovering the Romanovs de esta animación muestra cómo se utilizó el ADN mitocondrial para establecer la identidad de los restos de la familia real rusa. Como se ha estudiado en el Tema 1, actualmente disponemos de un catálogo amplísimo de otro tipo de marcador genético, los SNP. Hoy en día estos marcadores también se utilizan en genética forense, ya que algunos de ellos están fuertemente asociados con ciertos rasgos fenotípicos (color de los ojos, color del pelo, estatura, etc.) o con la procedencia geográfica. Por ejemplo, estudiando unos pocos SNPs de una muestra anónima se puede decir con bastante fiabilidad el origen geográfico o el color de los ojos de esa persona, y esto a veces ayuda en el terreno legal o forense. Los avances realizados en genética forense han llevado a los gobiernos de distintos países a poner en marcha bases de datos con perfiles genéticos de segmentos de la población más o menos amplios, lo cual tiene implicaciones ética, legales y sociales de cierta envergadura. En Estados Unidos, el FBI comenzó en 1998 una base de datos llamada CODIS (Combined DNA Index System), con más de dos millones de perfiles de 13 microsatélites, procedentes de individuos que han sido condenados por algún delito o de escenas criminales. En el Reino Unido, el National DNA Database (NDNAD) puede incluir el perfil genético (10 microsatélites) de cualquier ciudadano que sea arrestado por algún delito, aunque después sea declarado inocente. Según la policía británica, esta información ha ayudado a esclarecer más de crímenes desde su creación en 1998.