Caracteristicas del ADN. Se rompen con las siguientes condiciones -Temperaturas >90 - ph >10.5

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Adolfo Aguilera Acuña
hace 7 años
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1 PCR

2 Caracteristicas del ADN Se rompen con las siguientes condiciones -Temperaturas >90 C - ph >10.5

3 Baja astringencia tiene uniones parciales o imperfectas. Renaturalización Dependiendo de: -Contenido de sales -Temperatura -ph En alta astringencia solo se pega con las bases complementarias, perfectamente organizadas.

4 Tm Tm (Temperatura de fusión), es la temperatura a la cual el 50 % de los acidos nucleicos se mantiene disociado o desnaturalizado Calculo de Tm (método de G-C) Por ejemplo para la secuencia: ttc ccc ggt ctt gta aac c N= 10 # GC= 10 %GC= 52% Tm= 2 C * (A+T) + 4 C * (G+C) = = 2 * (9) + 4 (10) = 58 C corrección 58-5=

de G-C) Por ejemplo para la secuencia: ttc ccc ggt ctt gta aac c N= 10 # GC=

5 Blot

6 Digoxigenina

7 Tipos de transferencias Metodos Southern Transferencia de ADN Nothern Transferencia de ARN Westhern Transferencia de proteínas Blott Siembra en la membrana

8 Hibridación de colonias Plaqueo

11 Condiciones Químicas Reactivos Físicas Temperatura

12 Condiciones químicas dntps Deoxinucleotidos -trifosfato Amortiguador tris HCl y KCl Taq (Obtenida de Thermus aquaticus) Cebador 1 (hacia delante- Forward) Cebador 2 (hacia atrás - Reverse) ADN molde (templete)

13 Componente Mezcla maestra Mezcla maestra Vol/ reacción Concentración final / reacción Amortiguador 10 x 10 µl 1 x MgCl 2, 25mM * * dntp mezcla (10 mm de cada uno) 2 µl 200 µm de cada dntp Cebador forward (hacia adelante) variable 0.1 a 0.5 µm Cebador forward (hacia adelante) variable 0.1 a 0.5 µm Taq polimerasa ADN 0.5 µl 2.5 u H 2 O *ddue variable -- ADN molde variable < 1 µg/ reacción TOTAL 100 µl Concentración final Mg Volúmen requerido de 25mM

5 µm Cebador forward (hacia adelante) variable 0.1 a 0.5 µm Taq polimerasa ADN 0.5 µl 2.

14 Variables Cuidados y limpieza Secuencia del cebador (10-30 bases ) y del molde (hasta 10 Kb, en general de 100 a 1000 Kb) Concentración de componentes Cebador Molde 0.2, 0.4 a 0.8,1.0 micro M 1, 5 a 15, hasta 100 ng dntps (desoxinucleotidos) 50 a 220 micromolar Taq polimerasa0.9 a 0.2 u Cloruro de Magnesio 1.5 a 2.5 M Amortiguador (Tris HCL milimolar, ph 8.4 nota con la temperatura que se utiliza convencionalmente cambia de 6.8 a 7.8- con 50 a 55 milimolar de cloruro de potasio Condiciones termociclador

0 micro M 1, 5 a 15, hasta 100 ng dntps (desoxinucleotidos) 50 a 220 micromolar Taq polimerasa0.9 a 0.2 u Cloruro de Magnesio 1.

15 Concentración de ADN 1, 5 10, 15 ng Ojo con la contaminación

16 RAPDs Amplificación aleatoria de ADN polimórfico Usa un solo cebador El cebador de aproximadamante 10 bases

17 Cebadores universales Características básicas: 10 a 30 bases, aproximadamente 50% CG

18 Cebador 20 a 25 bases No forme pasadores Proporción similar de GC vs AT Específico

19 Ejemplo

20 Ciclo típico Desnaturalización inicial C ( 5 minutos) Desnaturalización Denaturation C (1 min) Alineación Annealing (al TM) C (1.5 min) Polimerización o Elongación Extension C (1 min/ Kb) Ciclos generalmente 25 a 35 Polimerización final 72 C 10 minutos

21 Tm Tm (Temperatura de fusión), es la temperatura a la cual el 50 % de los acidos nucleicos se mantiene disociado o desnaturalizado Calculo de Tm (método de G-C) Por ejemplo para la secuencia: ttc ccc ggt ctt gta aac c N= 10 # GC= 10 %GC= 52% Tm= 2 C * (A+T) + 4 C * (G+C) = = 2 * (9) + 4 (10) = 58 C corrección 58-5= 53 C

22 Número de ciclos

23 Grafica de las condiciones -Amplitud de cada etapa -Pendiente -Cambios en la corrida

24 Aplicaciones 1. Secuenciación Una de las razones mas comunes para el uso de la PCR es la formación de suficiente cantidad de ADN molde para su secuenciación. Es mucho mas sencillo y rapido que la clonación en células. 2. Estudios evolutivos Mediante la PCR se pueden amplificar genes de organismos ya extinguidos, como del mamut, o restos antiguos humanos. Se pueden comparar estos genes con los genes semejantes de organismos actuales y poder reconstruir árboles filogenéticos. El PCR también se ha utilizado para conseguir el mapa del genoma humano. 3. Huellas dactilares del ADN. La determinación de las huellas dactilares genéticas constituye una de las aplicaciones mas interesantes de la PCR.

25 Secuenciación Se utiliza Taq FS (fluorescente sequencing), a partir de la Taq polimerasa de Thermus aquaticus y modificada genéticamente de forma que posee muy baja actividad exonucleasa 5 ->3 y en consecuencia incorpora los ddntps marcados fluorescentemente

26 Estudios evolutivos y poblacionales PCR-RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) Este tipo de marcadores denominados Polimorfismos del ADN Amplificados Aleatoriamente, permiten analizar regiones homólogas del genoma de los individuos al amplificar al azar diferentes secciones del genoma.

27 VNTR (Variable Number of Tandem Repeats). La Variación en el Número de Repeticiones en Tira se enfoca al análisis de diferencias en la longitud de regiones repetitivas dentro del genoma nuclear no codificante. Los "minisatélites" se utilizan para efectuar una prueba denominada DNA fingerprint (huella digital del ADN) y es tan poderosa que permite individualizar organismos. Los "microsatélites" son otro tipo de repeticiones del genoma nuclear su análisis es similar al de las alozimas, pero en este caso el polimorfismo se basa en las diferencias en el número de repeticiones (longitud).

28 Pruebas de PCR

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