HIBRIDACIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOS: SOUTHERN BLOT

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1 HIBRIDACIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOS: SOUTHERN BLOT

2 HIBRIDACION DE ACIDOS NUCLEICOS APAREAMIENTO COMPLEMENTARIO DE BASES ENTRE DOS ACIDOS NUCLEICOS DE HEBRA SIMPLE PRODUCTO DE HEBRA DOBLE. DNA/DNA RNA/RNA DNA/RNA

3 HIBRIDACION DE ACIDOS NUCLEICOS Cómo se mantienen unidas las dos hebras? Puentes de hidrógeno entre las bases. Interacciones hidrofóbicas entre las bases adyacentes de una misma hebra.

4 FACTORES QUE AFECTAN LA ESTABILIDAD DE LA HIBRIDACION ENTRE ACIDOS NUCLEICOS Número de pares GC v/s pares AT Grado de complementariedad Largo de las hebras Concentración de sal en la solución Temperatura Concentración de formamida

5 Esquema Transferencia: capilaridad, vacío Fijación Hiridación Lavados Exposición: film de autoradiografía o Phosphorimager

6 Proceso de Hibridación - Electroforesis en gel de agarosa - Desnaturalización (NaOH 0,4 N), neutralización - Transferencia e inmovilización: membranas de nylon con luz uv, de nitrocelulosa en un horno de vacío y con calor - Prehibridación: evitar que la sonda marcada se pegue a la superficie de la membana donde no hay ADN. Buffer: SSC 6x; 0,1% SDS (p/v); formamida 40% (v/v); Denhardt 1x (Seroalbúmina bovina 2%, Ficoll 2%, Polivinilpirrolidona 2%); ADN de esperma de salmón desnaturalizado a una concentación final de 500 mg/ml - Hibridación: mismo buffer con 100 mg/ml de ADN de esperma de salmón + la sonda (de ADN: 200 pb 20 kb. Oligonucleótido: pb) - Lavados: Eliminan la sonda que no ha hibridado. SSC 2x o 0,1x; SDS. - Exposición Factores que afectan el proceso de hibridación: - Número de pares GC v/s pares AT - Grado de complementariedad - Largo de las hebras - Concentración de sal en la solución: Na + o Mg 2+ - Temperatura - Concentración de formamida

7 Southern Blot 1

8 Southern Blot 2

9 FACTORES QUE AFECTAN LA ESTABILIDAD DE LA HIBRIDACION ENTRE ACIDOS NUCLEICOS Número de pares GC v/s pares AT Grado de complementariedad Largo de las hebras Concentración de sal en la solución Temperatura Concentración de formamida

10 FACTORES QUE AFECTAN LA ESTABILIDAD DE LA HIBRIDACION ENTRE ACIDOS NUCLEICOS Número de pares GC v/s pares AT Mayor número de enlaces de H entre la hebras mayor estabilidad de los híbridos. 3 enlaces de H entre G y C 2 enlaces de H entre A y T

11 FACTORES QUE AFECTAN LA ESTABILIDAD DE LA HIBRIDACION ENTRE ACIDOS NUCLEICOS Grado de complementariedad Menor complementariedad de bases, menos enlaces de H formados menor estabilidad

12 FACTORES QUE AFECTAN LA ESTABILIDAD DE LA HIBRIDACION ENTRE ACIDOS NUCLEICOS Largo de las hebras Mayor largo de las hebras (cdnas) >200pb más enlaces de H mayor estabilidad del híbrido. Menor largo de las hebras (oligos) <50pb Mayor especificidad Menor probalidad de hibridación cruzada

13 FACTORES QUE AFECTAN LA ESTABILIDAD DE LA HIBRIDACION ENTRE ACIDOS NUCLEICOS Concentración de sal en la solución [sal] estabilidad del híbrido Cationes monovalentes (Na + ) o divalentes (Mg ++ ) Las cargas negativas de los grupos fosfato se repelen unas a otras. Los iones positivos en solución reducen la repulsión electrostática entre las hebras.

14 FACTORES QUE AFECTAN LA ESTABILIDAD DE LA HIBRIDACION ENTRE ACIDOS NUCLEICOS Temperatura Mayor Tº aumenta la energía cinética de las hebras y desestabiliza la estructura de los ácidos nucleicos. las hebras se separan.

15 FACTORES QUE AFECTAN LA ESTABILIDAD DE LA HIBRIDACION ENTRE ACIDOS NUCLEICOS ph [OH - ] ionización de los grupos fosfatos favoreciendo la repulsión electrostática entre las hebras. Concentración de formamida Probablemente forma enlaces de H con los ácidos nucleicos. Desestabiliza la formación de híbridos

16 El efecto combinado de estos factores puede ser expresado en una ecuación para el calculo de la Tm Qué es la Tm? Tm = temperatura de melting o de separación de las hebras. La Tm es una medida de la estabilidad de los híbridos definida como la temperatura a la cual 50% de los híbridos se encuentran formados y 50% permanecen disociados. 50% %

17 El efecto combinado de estos factores puede ser expresado en una ecuación para el calculo de la Tm Para DNA:DNA Tm = 81,5 ºC + 16,6log[Na] + 41(%G+C) - 0,63(%formamida) - (500/L) Para DNA:RNA Tm = 79,8 ºC + 18,5log[Na] + 58,4(%G+C) + 11,8(%G+C) 2-0,5(%formamida) - (820/L) Para oligonucleotidos en 1 M Na+ Tm ( o C) = 4 (G+C) + 2 (A+T)

18 Marcaje de la sonda - Marcaje por nick translation a 32 P-dCTP Digoxigenina - Marcaje terminal g 32 P-ATP, Polinucleótido kinasa P-TGTAAGNNN. - Rellenado de extremos a 32 P-dCTP Klenow NNNGTAAG NNNCATTCCTAG - Random priming ADN desnaturalizado, primers de 6 pb, Klenow - Transcripción Sonda de ARN a partir de un molde de ADN. ARN polimerasa T4, T7 o SP6

20 Marcaje con digoxigenina BCIP: 5-bromo-4-cloro-3-indolil fosfato NTP: Nitroblue tetrazolim salt 1,2-dioxietano sustrato: AMPPD

21 Reutilización de filtros: La sonda puede ser eliminada tras la hibridación y reutilizarse el filtro. Lavado con NaOH 0,25 N, 2% SDS, o con formamida a temperatura elevada. - Estas técnicas de marcaje e hibridación para Southern blot son válidas esencialmente, con algunas modificaciones, para otras técnicas de hibridación: Northern, hibridación de colonias de E. coli, rastreo de genotecas en fagos, etc.

22 SCREENING (RASTREO) DE UNA GENOTECA MEDIANTE HIBRIDACIÓN

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