TECNICAS DE BIOLOGIA MOLECULAR

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Isabel Romero Soriano
hace 5 años
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1 Química Biológica Patológica TECNICAS DE BIOLOGIA MOLECULAR III- Parte Aplicadas al diagnóstico de Enfermedades Genéticas Tema:1 (1) Dra. Silvia Varas

2 GENERALIDADES

3 Electroforesis en Gel de Agarosa Poros de tamaño mediano. Se utiliza para separar cadenas de ADN doble cadena.tamaño de 100 pb a 10 Kb ADN total digerido con enzimas de restricción, productos de PCR mayores de 100pb RNA total previo a una transferencia a membrana (Northern Blotting) Utiliza cubas horizontales.

4 ELECTROFORESIS EN GEL DE AGAROSA % Concentración Rango pb Xileno de cianol 5 Kb Azul de bromofenol 0.5 Kb

5 Electroforesis en Gel de Poliacrilamida Poros de tamaño pequeño. Se utiliza para separar cadenas de ADN simple cadena.rango de separación 10 pb a 500 pb Permite diferenciar cadenas de ADN simple cadena en 1 pb de diferencia (gelesde secuenciamiento) Utiliza cubas verticales

6 ELECTROFORESIS EN GEL DE POLIACRILAMIDA Acrilamida [CH 2 =CHCONH 2 ] n Metilen-bis-acrilamida (CH 2 =CHCONH 2 ) 2 CH 2 % Gel PAA Rango pb En presencia de Persulfato amónico y TEMED (N.N,N, N tetrametiletilendiamina)

7 Enzimas de Restricción Cuando una bacteria es invadida por un organismo que contiene ADN, por ej por un virus, se puede defender con las enzimas de restricción (ER), denominadas también como endonucleasas. ER reconocen una corta secuencia de ADN en forma especifica y corta ambas hebras. La secuencia de reconocimiento es un palíndrome. ER son bautizadas con el nombre de la bacteria donde se aisló, mas un número de secuencia (por ej. Eco RI).

8 Enzimas Restricción Sub-unidades Catalíticas Sub-unidades Reconocimiento

9 Ejemplo: (Eco RI) (corta) 5 GAATTC 3 3 CTTAAG 5 (corta)

10 Los enzimas de restricción son proteínas homodímericas y reconocen secuencias de DNA palindrómicas BamHI G ' GATCC SITIO INESPECÍFICO SITIO ESPECÍFICO

11 TIPOS DE CORTE PRODUCIDOS POR E. RESTRICCIÓN Extremos cohesivos 3 Extremos romos Extremos cohesivos 5

13 Definiciones Una probeo sonda es un secuencia de oligonucleótidos simple hebra y esta marcado con radio isótopo ( 32 P) o fluorescente. Su secuencia es complementaria a la secuencia de interés, cuya secuencia es conocida. Hibridización: unión por apareamiento de bases de dos moléculas de acido nucleico. Tm: Temperature melting= temperatura a la cual las hebras de un duplex están disociadas en un 50%.

14 Calculo de Tm Tm [ºC]= 2(nºA + T) + 4(nºG + C) Ejemplo: S- IGFI: AGC CTC GAC AGC CTG CCC CAG G Tm [ºC]= 2( 4 + 2) + 4( ) Tm [ºC]= 2(6) + 4(16) Tm [ºC]= = 76 Tm = 76 ºC

15 DESNATURALIZACIÓN DEL DNA 1. Composición de bases 2. Longitud DNA doble 3. Fuerza iónica

16 Factores que afectan la velocidad de hibridización Longitud del acido nucleico. Composición de base. Fuerza iónica. Viscosidad. Temperatura Agentes desnaturalizantes. ph

17 Longitud del acido nucleico. K longitud Composición de base. >% CG aumenta la re-asociación Fuerza ionica. Viscosidad > Na+ aumenta la re-asociación Polímeros de alto PM (PVP, Dextran, Ficoll): aumenta la velocidad de reasociación. Moléculas pequeñas (glicerol, sacarosa): disminuye la velocidad de re-asociación.

18 Temperatura A >T se rompen las uniones ptes de H. Se define como la t óptima de hibridización a aquella donde la velocidad de hibridización es máxima. Y es gralmente 25 por debajo de la T de melting. Agentes desnaturalizantes. Formamida: Baja la T óptima de hibridización de 0,72 C cada 1% ph A una [NaCl] de 0,4M la velocidad de hibridizaciónes independiente del ph (en un rango de 5-9).

19 SC TIPOS de SECUENCIAS en el ADN GENOMICO Altamente Repetitivo 1) Altamente repetitiva: VNTR, STR 2) Medianamente repetitiva: Secuencias Alu, trasposones (LTR), RNAr, histonas, telomeros. 3) DNA copia única Genes estructura exon-intron. Medianamente Repetitivo Copia Unica DC

20 Genes con estructura exon-intron Caja Caja TATA Enhancer GC CAAT 5 UTR GT AG GT AG 3 UTR 3 TGA FT + FTII RNA pol II +1 Transcripción UGA Señal de clivaje y poliadenilación 20-30nt RNA Transcripto Primario NUCLEO 5 UTR GU AG GU AG 3 UTR AAUAAA Capping y Poliadenilación UGA CAP 5 UTR GU AG GU AG 3 UTRAAAAAAAAA 7-metilguanosina RNA nuclear pequeño (snrna) Spliceosoma Splicing UGA GU GU CAP 5 UTR AG AG 3 UTRAAAAAAAAA GU AG Lazo o LARIAT RNA mensajero MADURO CAP 5 UTR 3 UTRAAAAAAAAA CITOPLASMA

21 Polimorfismo genético LOCUS POLIMORFICO: es una variante muy común que se encuentra en más del 1% de los cromosomas de la población en general. MUTACION Tipos de POLIMORFISMOS: - SNP: Polimorfismos de nucleótido único - Polimorfismos Repetitivos: VNTR, STR, etc. - Polimorfismos de Restricción: RFLP

22 SNP: Polimorfismos de nucleótido único Los SNP son comunes y ocurren una vez cada 1000 pares bases. Marcarían la susceptibilidad a una enfermedad mas que su causa directa

23 Polimorfismos Repetitivos VNTR (Variable number of tandem repeat), Ej: [CTGATCTATAGTAC]n STR, (Short tandem repeat), Ej: [ CG ] n Donde n= 20, 50 ó 70 veces

24 RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphisms) Como se puede detectar un RFLP? a) Por técnicas de Southern Blotting 1. Extracción de ADN 2. Digestion con la Enzima de Restricción apropiada 3. Separación de los fragmentos por electroforesis y transferencia a membrana (Southern Blotting) 4. Hibridización con la Sonda o Probe especifica, revelado. 5. Análisis de los resultados

25 Condición: RFLPs La presencia de una mutación es ligada a un polimorfismo de restricción La mutación y el polimorfismo no deben estar separados a una distancia mayor de 10 6 nucleótidos para que sean coheredados juntos.

26 C B A

27 PCR: PRINCIPIOS

28 Kary Mullis, el inventor de la PCR fue premiado en 1993 con el Premio Nobel en Química

29 Termocicladores para PCR

30 El ciclo de amplificación de PCR Cada ciclo requiere tres pasos de temperaturas para completar un ronda de la síntesis de ADN.

31 El perfil de temperatura de un ciclo de PCR es controlado por el programa del termociclador. Hay un incremento exponencial del producto de PCR hasta cerca del ciclo nº 30.

32 La Reacciónen Cadenade la Polimerasa (PCR) PCR es una técnica la cual es usada para amplificar un numero de copias de una región especifica del ADN hasta producir una cantidad de ADN que sea adecuadamente testeada. El propósito de la PCR es hacer un alto numero de copias de un gen. Como resultado es posible y caracterizar fragmentos de ADN hallados en una gota de sangre, en una escena de crimen o de un dinosaurio extinguido.

33 Definición PCR es un sistema no celular de clonado del ADN Es un método de amplificación selectiva de secuencia específicas. A partir de una población heterogénea de moléculas, como puede ser ADN genómico o cdna. PCR es un proceso de replicación in vitro.

34 Ventajas y Desventajas VENTAJAS: Rapidez Sensibilidad Fortaleza DESVENTAJA DE PCR COMO METODO DE CLONADO: Se debe conocer la secuencia Producto generalmente pequeño Infidelidad de la replicación del ADN

35 Nomenclatura Hebras de ADN! Cadena Codificante, Informativa, sens o cadena (+) Secuencia publicada en Gene Bank! Cadena Molde, no-codificante, no-informativa, antisentido(anti sens) o cadena (-)

36 Paso 1: Desnaturalización del DNA Estoocurrea ºC

37 Paso 2: Annealing o Unión de Primers Reverse Primer Forward Primer Los cebadores se unen a la secuencia complementaria sobre DNA target.

38 Paso 3: Extensión o Primer Extension 5 3 extension 3 5 extension 3 5 DNA polimerasa cataliza la extensión de la hebra en sentido 5 3

39 El nuevo ciclo se inicia por desnaturalización de las nuevas hebras formados en el ciclo previo.

40 Amplificación Exponencial Ciclos Copias

41 Fases en una reacción de PCR El producto de PCR se acumula en función del número de ciclos. Se distinguen las siguientes fases: La fase exponencial hasta cerca del ciclo 30 esta bajo las condiciones estándar de reacción. La faseplateau resulta de cantidades limitantes de enzima y/o reducción actividad enzimática.

42 Causas de Efecto Plateau Agotamiento de los sustratos (dntps o primers). Estabilidad de los reactivos (dntps o enzima) particularmente a la tº de desnaturalización. Inhibición por los productos finales generados (pirofosfato, duplex de DNA).

43 El tamaño del fragmento producido en PCR depende de los primers Reverse primer Forward primer Tamaño de los fragmentos que son amplificados

44 Elementos de una PCR especifica 1) Templado 2) Enzima 3) Iniciadores Calidad Concentración Secuencia Concentración, pureza y estabilidad 4) Temperatura de anneling 5) Concentración de Magnesio 6) Concentración de Nucleótidos 7) Condiciones del medio: Buffer, ph, etc. 8) Aditivos: Formamida, DMSO, glicerol, etc.

45 Temperatura de anneling Temperatura de Annealing: ~ 5 o C menos que la Tm de los primers Tm = 4(G + C) + 2(A + T) o C (o usar el Tm provisto por planilla del proveedor) en la tº anneling resulta en una union noespecífica. en la tº annealing resulta en reducción en el rendimiento

46 G: 3 ; A: 11 C:5 ; T: 7 TOTAL= 26 nt Tm= =32+36=68ºC

47 Típica reacción de PCR: 1. El

48 PCR En un tubo de PCR con una mezcla de DNA genómico, DNA polimerasa, buffer, Mg 2+ nucleótidos trifosfatos y primers Termociclador

49 PROCEDIMIENTO..

50 Elementos de Laboratorio

51 TUBOS EPPENDORF 200 µl 500 µl 1,5ml

52 Pipetas Automáticas P-1000 P-200 P-100 P µl µl µl 0,5-10 µl

53 Termocicladores

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