Repaso de PCR y qpcr

Tamaño: px

Comenzar la demostración a partir de la página:

Download "Repaso de PCR y qpcr"

Cristina Soto González
hace 7 años
Vistas:

1 Repaso de PCR y qpcr 1. Los siguientes oligonucleótidos se utilizaron para amplificar una región específica de DNA o RNA, el diseño es variable de acuerdo a el propósito de los oligonucleótidos, a continuación se da una lista de los posibles uso para los que fueron diseñados estos oligonucleótidos con su respectiva representación. a. Amplificación del marco de lectura b. PCR anidada c. PCR cuantitativa (tiempo real)

d. Retro transcripción ( paso de RNA a CDNA) e. Síntesis de cdna (representativo solo de la expresión de mrna) a partir de RNA total f. Detección de mutaciones 2.

2 d. Retro transcripción ( paso de RNA a CDNA) e. Síntesis de cdna (representativo solo de la expresión de mrna) a partir de RNA total f. Detección de mutaciones 2. Se ha realizado una estrategia de amplificación para verificar si el producto de interés (gen x) se encuentra o no en los sujetos a estudiar, se sabe que el producto tiene un peso de 200 kb. Se cuenta con un control positivo y negativo (carril 7 y 6 respectivamente), al realizar el análisis del producto de amplificación (vía electroforesis en gel) se observó que las muestras 2, 3 y 4 son positivas y si es perceptible alguna diferencia entre ellas siendo la más positiva la muestra 3 y 4, los carriles 1 y 8 son lo marcadores de peso molecular.

3 Las siguientes son dos representaciones de los métodos de detección para la PCR en tiempo real Sondas TaqMan (fluorocromo unido a una molécula que mantiene retenida roba la fluorescencia) Alineamiento de la sonda y primers Amplificación Detección con materiales intercalantes en el producto de PCR (en el surco menor de la doble hebra de DNA) Alineamiento de la sonda y primers Amplificación

4. En la siguiente grafica se muestran las curvas de amplificación de un ensayo de qpcr, las muestras cuya curva comienza a hacerse visible a ciclos tempranos son las que cuentan con mayores niveles

4 4. En la siguiente grafica se muestran las curvas de amplificación de un ensayo de qpcr, las muestras cuya curva comienza a hacerse visible a ciclos tempranos son las que cuentan con mayores niveles de expresión. Si analizamos el grafico, la curva en color vino es la que posee mayor cantidad de mrna (se señala con una flecha) y la curva en verde es la que cuenta con menor nivel de expresión (señalado con una estrella) 5. El siguiente resultado muestra la expresión genética de los genes CYP2C11 y CYP2E1 en presencia del isoproterenol, la expresión de ambos genes en diferentes tejidos sin el efecto del isoproterenol es decir la expresión normal es tomado como control y relativizado (normalizado) a un valor de 1, el gen que se usó como expresión de referencia es el GAPDH; la expresión de ambos genes es subexpresada en presencia de isoproterenol, de igual forma se observa para ambos genes una ligera disminución en pulmón pero sin ser significativa, en hígado CYP2C11 disminuye ligeramente, mientras que CYP2E1 aumenta ligeramente, ninguna de las dos modulaciones es significativa, mientras que en riñon en presencia de isoproterenol ambos genes se sobreexpresan siendo mas evidente y significativo CYP2E1

5 6. En la siguiente grafica se demuestra la expresión normalizada (control se relativizo con un valor de 1) de varios genes, en la gráfica C representa la expresión control y E la expresión problema. Se enlistan a continuación los sobre y sub expresados Sobrexpresados: B-crystallin, MAFB, Prox-1 Subexpresados: Delta-1, a-crystalli, g-criystallin, Sox2, Sox1 Pax 6 tiene una expresión igual tanto en el control como en el problema 7. la siguiente grafica también es una representación de la expresión genética de cierto mrna, debido a que la expresión relativa se realizó mediante el análisis de ΔCP (CP del gen problema CP del gen de referencia), la muestra que tiene mayor expresión es la muestra N, debemos recordad que el valor de ΔCP es inversamente proporcional al nivel de expresión, es decir a menor valor numérico mayor expresión y a mayor numérico menor expresión.

6 Adicionalmente favor de repasar los conceptos de PCR, cuales son los requisitos para realizarla. La PCR se basa en el mecanismo de la replicación in vivo del ADN: el ADN bicatenario se desenrolla y pasa a ADN monocatenario, se duplica y se vuelve a enrollar. Esta técnica consiste en ciclos repetitivos de: 1. Desnaturalización: la hebra molde se abre y se forman dos hebras monocatenarias, este proceso se logra por medio del rompimiento de los puentes de hidrogeno formados entra ambas hebras utilizando una temperatura de C. Como resultado tendremos una gran cantidad de bases nucleotidicas desapareadas (en un sistema in-vitro este paso se realiza con ayuda de las helicasas) 2. La re hibridación de las hebras de ADN y los cebadores se logra a una temperatura de 55 a 65 C, en esta etapa se forman y rompen diverso puentes de hidrogeno pero perduran los que se encuentren mas estables (que el apareamiento de las bases corresponda con exactitud), en estos fragmentos de ADN bicatenario es donde se puede fijar la polimerasa. (los primers tiene como equivalente en el proceso in-vivo a los pequeños primers de RNA que se sintetizan por la RNA primasa para que en estos sitios se una la polimerasa) 3. Extensión: La polimerasa va elongando el extremo 3 del cebador añadiendo nucleótidos complementarios a la hebra molde, este paso se realiza a una temperatura de 72 C y el tiempo dependerá de la longitud del fragmento a elongar, tomando en cuenta que se añaden 25 b por segundo, en este paso es cuando se unen los nucleótidos (dntps), esto lo realiza la polimerasa que debemos recordar que existen muchos tipos de polimerasas de alta o baja fidelidad dependiendo de su taza de error, polimerasas que tienen actividad a temperatura de 37 C o que se activan a altas temperaturas ya que han sido modificadas al agregarles un anticuerpo bloqueador del sitio de actividad enzimática, modificadas químicamente o uniendo la enzima Taq a perlas de cera. Los requerimientos son: 1. DNA molde 2. dntps (citosina, guanina, adenina, timina) 3. Oligonucleótidos: secuencias cortas de nucleótidos, diferentes entre si y complementarios al sitio de reconocimiento del ADN que desea amplificarse 4. Magnesio /Buffer/agentes desestabilizantes 5. Enzima Taq Polimerasa: la polimerasa es una enzima aislada de la bacteria Thermus aquaticus, esta enzima se active a altas temperaturas. Tambien existen las enzimas Pfu polimerasa, aislada de la bacteria Pyrococcus furiosus.

Documentos relacionados

TEMA 14 NUEVAS TECNOLOGÍAS PARA EL ESTUDIO DE LAS ENFERMEDADES INFECCIOSAS: MÉTODOS GENÉTICOS

TEMA 14 NUEVAS TECNOLOGÍAS PARA EL ESTUDIO DE LAS ENFERMEDADES INFECCIOSAS: MÉTODOS GENÉTICOS Tema 14. Nuevas tecnologías para el estudio de enfermedades infecciosas: métodos genéticos Métodos genéticos