TEMA 14 NUEVAS TECNOLOGÍAS PARA EL ESTUDIO DE LAS ENFERMEDADES INFECCIOSAS: MÉTODOS GENÉTICOS

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María del Carmen Salas Silva
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1 TEMA 14 NUEVAS TECNOLOGÍAS PARA EL ESTUDIO DE LAS ENFERMEDADES INFECCIOSAS: MÉTODOS GENÉTICOS

2 Tema 14. Nuevas tecnologías para el estudio de enfermedades infecciosas: métodos genéticos Métodos genéticos 1.Técnicas de hibridación de los ácidos nucleicos Marcado de la sonda Tipos de hibridación Hibridación en solución Hibridación sobre fase sólida Hibridación in situ Utilización de las sondas 2. Técnicas de amplificación Reacción en cadena de la polimerasa (PCR) Detección de productos de PCR

3 Métodos genéticos - Varios métodos que analizan el ADN o el ARN microbianos pueden detectar, identificar y caracterizar etiologías infecciosas - Aunque los aspectos técnicos pueden diferir, todos los procedimientos moleculares involucran la manipulación y el análisis directo de genes en lugar de analizar los productos del gen (proteínas) - Además, debido a que los ácidos nucleicos son comunes a todos los seres vivos, la mayoría de los métodos son adaptables al diagnóstico de infecciones virales, micóticas, parasitarias o bacterianas

4 Métodos genéticos En los laboratorios de microbiología clínica, las técnicas genéticas se utilizan, entre otros fines, para: - la detección de microorganismos directamente en las muestras clínicas identificando un fragmento específico del genoma del microbio - la identificación de un microorganismo tras su aislamiento por métodos convencionales - estudios de epidemiología molecular que permiten comparar las cepas aisladas (tipificación)

5 Métodos genéticos Los métodos genéticos basados en el análisis de ácidos nucleicos se clasifican en dos categorías: 1.1. Técnicas de hibridación de los ácidos nucleicos 1.2. Amplificación de fragmentos de ADN mediante reacción en cadena de la polimerasa (PCR)

1.Técnicas de hibridación de los ácidos nucleicos - Una particularidad del ADN consiste en que cuando se calienta por encima de 90ºC, las dos cadenas se separan (desnaturalización) y cuando desciende

6 1.Técnicas de hibridación de los ácidos nucleicos - Una particularidad del ADN consiste en que cuando se calienta por encima de 90ºC, las dos cadenas se separan (desnaturalización) y cuando desciende la temperatura las bases vuelven a aparearse de nuevo enlazándose con toda exactitud los fragmentos homólogos (renaturalización). - Si se conoce una secuencia propia y específica del ADN de un determinado microorganismo, puede sintetizarse un fragmento de ADN con la secuencia complementaria que después se marca con un compuesto radiactivo, fluorescente o lumínico - Cuando estos pequeños fragmentos monocatenarios (20-40 bases) están marcados y se emplean para la detección de su secuencia complementaria se denominan sondas

7 Marcaje de la sonda Marcaje de la sonda - Inicialmente, las sondas se marcaban con sustancias radiactivas 32 P o 35 S - En la actualidad se utilizan sustancias no radiactivas como enzimas (peroxidasa de rábano, fosfatasa alcalina), sustancias lumínicas (ésteres de acridina)

8 Tipos de hibridación - Las sondas detectan la secuencia complementaria en el genoma de un microorganismo a través de una prueba de hibridación realizada: en solución, sobre un soporte sólido, o in situ Hibridación en solución (en un tubo) - Se extrae el ADN del microorganismo, se desnaturaliza en solución en un tubo y se añade la sonda marcada con acridina - Si encuentra su secuencia complementaria se une para formar un fragmento bicatenario - A continuación, se añade un álcali, que inactiva la acridina cuando la sonda está libre, pero no cuando la sonda ha hibridado con su secuencia, por lo que la luminiscencia medida por un luminómetro corresponde a la sonda hibridada

9 Hibridación sobre fase sólida (en una membrana de nylon o nitrocelulosa) - Se extrae el ADN después de lisar los microorganismos de una muestra clínica o de un cultivo, se desnaturaliza por calor y se deposita una gota sobre una membrana de nailon o de nitrocelulosa - La muestra depositada se absorbe y se fija - Se sumerge la membrana en una solución de hibridación que contiene la sonda marcada - Finalizada la hibridación se lava la membrana para eliminar la sonda no unida - Se detecta la sonda fijada a través del marcador - Se utiliza sobre todo con fines de investigación

10 Hibridación in situ (en un portaobjetos con un corte de un tejido) - Se denomina así a la hibridación que se realiza sobre un corte histológico de un tejido - Cuando la sonda se une con un ADN complementario emite la señal correspondiente y se puede localizar el microorganismo en el contexto del tejido

11 Utilización de las sondas - A pesar de su especificidad, las sondas carecen de suficiente sensibilidad para detectar los microorganismos de una muestra clínica cuando son escasos, por lo que en la actualidad se emplean poco para este fin - Por el contrario, constituyen un instrumento excelente para identificar un microorganismo una vez aislado por cultivo, ya que se dispone de ADN en abundancia - Resultan particularmente útiles para los microorganismos cuya identificación por métodos convencionales es difícil o compleja

12 2. Técnicas de amplificación - Permiten multiplicar in vitro el número de copias de un fragmento de ADN (algunas técnicas permiten amplificar también el ARN) del genoma de un microorganismo, disponiendo de él en abundancia - Son las técnicas de elección para la detección e identificación de microorganismos directamente en muestras clínicas, especialmente en los casos en que los métodos convencionales son lentos, laboriosos o inexistentes

13 Técnicas de amplificación Reacción en cadena de la polimerasa (PCR) - La reacción en cadena de la polimerasa, descrita por Kary Mullis en 1983, aplica la bioquímica básica de la replicación del ADN con el objetivo de amplificar una región particular del ADN que, por lo general, contiene información útil desde el punto de vista diagnóstico - La mezcla de reacción para PCR consta de: - ADN molde que se va a amplificar - cebadores u oligonucleótidos - los cuatro nucleótidos trifosfato (dntps) - una ADN polimerasa termoestable (Taq-polimerasa, obtenida de la bacteria termófila Thermus aquaticus) (necesita Mg 2+ )

14 Reacción en cadena de la polimerasa (PCR) - Los cebadores son fragmentos cortos monocatenarios de ADN de entre 12 y 20 nucleótidos, sintetizados artificialmente, complementarios uno de ellos de un fragmento de una cadena y el otro de un fragmento de la otra cadena situado entre 100 y bases de distancia

15 Ciclo de temperaturas de la PCR La amplificación del fragmento delimitado por los dos cebadores se consigue mediante el siguiente proceso: A) Desnaturalización: las dos cadenas de la molécula original de ADN se separan por calor, elevando la temperatura de la mezcla de reacción hasta aproximadamente 95ºC durante 15 segundos a 1 minuto B) Hibridación: la mezcla se enfría a una temperatura entre 40 y 65ºC durante unos 30 segundos, lo que permite la unión de los cebadores a sus secuencias complementarias, uno en cada cadena; la renaturalización del ADN original entre sí es mínima porque hay un exceso de cebadores C) Polimerización o extensión del cebador: se lleva a cabo durante 30 segundos a 5 minutos a 72ºC, temperatura óptima para la Taq-polimerasa que se ha unido a cada uno de los fragmentos bicatenarios ADN-cebador, produciéndose las copias de ambas cadenas

16 Ciclo de temperaturas de la PCR 95ºC desnaturalización 72 ºC 40-65ºC hibridación extensión X 35 ciclos 1 min 30s-1 min 45 s-2 min Tiempo (minutos)

cada dos cadenas iniciales existen cuatro -Se inicia un nuevo ciclo calentando a 95ºC

17 Reacción en cadena de la polimerasa (PCR) Calentar a 95ºC Las cadenas de ADN se separan Enfriar a 55ºC Los cebadores se unen a las cadenas de ADN - Al final de este proceso, por cada dos cadenas iniciales existen cuatro -Se inicia un nuevo ciclo calentando a 95ºC Calentar a 72ºC La Taq-polimerasa sintetiza nuevas cadenas de ADN Dos nuevas moléculas de ADN

Reacción en cadena de la polimerasa (PCR) - La PCR se

termociclador, que va repitiendo las tres fases del

señalado - Tras 20-30 ciclos (de dos a tres horas) se

18 Reacción en cadena de la polimerasa (PCR) - La PCR se lleva a cabo en un instrumento automático, denominado termociclador, que va repitiendo las tres fases del proceso, variando la temperatura según el programa señalado - Tras ciclos (de dos a tres horas) se consiguen millones de copias del fragmento original 1983 actualmente

19 Detección de los productos de PCR - Los fragmentos de ADN amplificados reciben el nombre de amplicones - Realizando una electroforesis en gel de agarosa se puede determinar el tamaño del amplicón para confirmar que se trata del fragmento buscado.

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