Métodos para Inmunidad Viral

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1 Métodos para Inmunidad Viral

2 Radioinmunoensayo (RIA) Técnica muy sensible basada en la competencia de unión al anticuerpo específico entre el antígeno a cuantificar y cantidades conocidas del antígeno marcado con un isótopo. A mayor antígeno a cuantificar, menor será el antígeno marcado unido al anticuerpo y viceversa.

3 Enzimoinmunoanálisis (EIA) Directo Detecta al antígeno y se basa habitualmente en la captura del antígeno por anticuerpos específicos unidos a una fase sólida El antígeno presente en la muestra se combina con el anticuerpo fijado. El antígeno se detecta con otro anticuerpo específico conjugado a una enzima, se adiciona un sustrato para la enzima y se mide la intensidad de color.

4 Enzimoinmunoanálisis Indirecto Se ha aplicado de manera amplia en el diagnóstico de anticuerpos virales. Los antígenos virales se inmovilizan sobre una fase sólida, se agregan los sueros en estudio y se revela la reacción con un anticuerpo específico conjugado con una enzima, se añade un sustrato al cual la enzima convierte de incoloro a un producto coloreado.

5 EIA Indirecto

6 Análisis inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA) Permite identificar inmunocomplejos por medio de enzimas unidas al antígeno o anticuerpo, estando uno de ellos adsorbido a un soporte sólido (placa de poliestireno). La reacción antígeno-anticuerpo se detecta mediante la utilización de un marcador, una enzima (peroxidasa ó fosfatasa), conjugada químicamente al antígeno o al anticuerpo en su caso, se añade un sustrato y la reacción entre ellos da un producto coloreado.

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8 ELISPOT Incorpora el ensayo inmunoenzimático en fase sólida ELISA Prueba diseñada originalmente para la detección de células B secretoras de anticuerpos antígeno específicos Se ha adaptado para la detección de células secretoras de citocinas específicas u otros antígenos

9 ELISPOT Es un método sensible y selectivo para el estudio de citocinas, no requiere estimulación previa para reflejar la situación in vivo Para células T, por ejemplo, el IFN-γ secretado por las células en cultivo, es capturado en las inmediaciones de la células por un anticuerpo específico anti- IFN-γ adsorbido en el fondo del pozo

10 ELISPOT Las células se retiran mediante lavados sucesivos y se adiciona un segundo anticuerpo específico anti-ifn-γ, marcado con una enzima, el cual va a adherirse al interferón inmovilizado por el primer anticuerpo; al adicionar el sustrato de la enzima, se forma un producto colorido insoluble que permite ver el sitio en donde se encontraba la célula secretora de IFN-γ como una mancha de color.

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12 Inmunofluorescencia Es una técnica histoquímica o citoquímica, útil para detectar y localizar antígenos en células o tejidos, permitiendo conservar las estructuras finas de la célula. En el método directo, se utiliza un anticuerpo específico conjugado con un compuesto fluorescente (isotiocianato de fluoresceína, p. ej.) dando como resultado una marca que permite localizar al antígeno.

13 Inmunofluorescencia Directa. El anticuerpo conjugado se añade directamente a la sección de tejido o suspensión de células viables Indirecta. Se basa en la unión de anticuerpos antivirales a los antígenos virales expresados en la superficie y en el citoplasma de células infectadas (fijadas en un portaobjetos). Útil para la determinación de anticuerpos antivirales en el suero del paciente.

14 Inmunofluorescencia Puede usarse para detectar el virus de la influenza A y B; Parainfluenza 1, 2, 3 y Adenovirus, entre otros

15 Virus de la influenza Presencia de anticuerpos en el citoplasma y superficie de las células infectadas

16 Aglutinación pasiva La aglutinación de las partículas de látex u otros soportes, recubiertos por un antígeno específico, permite la detección de anticuerpos libres, específicos para el antígeno. Se basa en las interacciones Ag-Ac, donde la cantidad y especificidad de la reacción se evalúa por los cambios físicos inducidos tras la unión del anticuerpo específico con su antígeno correspondiente para formar inmunocomplejos, facilmente detectables.

17 Hemaglutinación pasiva Ciertos virus (influenza, parainfluenza y togavirus) producen antígenos que logran acoplarse de manera espontánea a los eritrocitos y forman reactivos estables para la detección de anticuerpos. Esta reacción puede inhibirse usando un anticuerpo específico antiviral. De esta manera la hemaglutinación puede usarse para cuantificar el virus y el título de anticuerpos contra el virus hemaglutinante

18 Western Blot (WB) Con el uso combinado de electroforesis y ELISA puede determinarse la respuesta a una diversidad de proteínas específicas a patógenos Este procedimiento proporciona un medio específico para identificar reactividad de anticuerpos

19 Western Blot (WB) Se basa en la separación de los antígenos virales mediante una electroforesis en gel de SDS-PAGE (lo cual proporciona una carga negativa a la proteínas). Las proteínas virales son sometidas a una electroforesis en un gel de poliacrilamida. Como las proteínas están cargadas negativamente se separan con base en su peso molecular (las más grandes permanecen en la parte superior del gel y las menores migran hacia la base).

20 Western Blot (WB) Las proteínas se transfieren a un soporte sólido (papel de nitrocelulosa, nylon), lo cual da una copia exacta del patrón del gel en la matriz. La identificación de las proteínas a estudiar se realiza usando un ELISA indirecto. Las reacciones se leen como positivas cuando una línea de precipitación o color se forma en el peso molecular correcto para una proteína particular.

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