ELISA y Western Blot

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María Moreno Sosa
hace 5 años
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1 Universidad Central de Venezuela Facultad de Medicina Escuela de Medicina José María Vargas Cátedra de Inmunología ELISA y Western Blot Práctica Prof. Edwin Escobar edscobar@gmail.com

2 Aplicaciones Diagnósticas de las Interacciones Ag/Ac ELISA

ELISA Ensayo de Inmunadsorción Ligado a Enzima Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay Mide la cantidad de complejo Ag/Ac formado Utiliza reactivo detector conjugado a una enzima

3 ELISA Ensayo de Inmunadsorción Ligado a Enzima Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay Mide la cantidad de complejo Ag/Ac formado Utiliza reactivo detector conjugado a una enzima Reacción colorimétrica en presencia de sustrato cromógeno Intensidad de color proporcional a cantidad de complejo Ag/Ac

4 ELISA Indirecto Detección de anticuerpos específicos en el suero del paciente Aplicaciones: Diagnóstico de Infección o exposición a microorganismos Detección de Autoanticuerpos Respuesta a Inmunizaciones/Vacunas Captura Diagnóstico de Infección por VIH-1 Marcador Identificado Detección Revelado Agregar Lavado Lavado Ag de VIH-1 Proteínas Recombinantes IgG anti-vih-1 Anticuerpos en Suero del Paciente Anti-IgG Conjugados a Enzima Reacción de Color Sustrato Cromógeno Inmunología de Kuby

ELISA Tipo Sándwich Detección de antígenos específicos en

microbianos Determinación de Hormonas, Citoquinas, Drogas,

Determinación de Antígeno de Superficie del Virus de

Revelado Agregar Lavado Lavado Ac Anti-HBsAg HBsAg

5 ELISA Tipo Sándwich Detección de antígenos específicos en el suero del paciente Aplicaciones: Detección de Ag microbianos Determinación de Hormonas, Citoquinas, Drogas, Marcadores Tumorales, etc. Determinación de Antígeno de Superficie del Virus de Hepatitis B Captura Marcador Identificado Detección Revelado Agregar Lavado Lavado Ac Anti-HBsAg HBsAg Antígeno en Suero del Paciente Anti-HBsAg Conjugados a Enzima Reacción de Color Sustrato Cromógeno Inmunología de Kuby

ELISA Competitivo El antígenos específico en el suero del paciente compite con el antígeno unido a

La intensidad de color es inversamente proporcional a la cantidad de Ag en la muestra Aplicaciones:

Determinación de Gonadotropina Coriónica Humana (h-cg) Captura IgG Antih-CG Marcador Identificado

6 ELISA Competitivo El antígenos específico en el suero del paciente compite con el antígeno unido a la fase sólida para unirse al anticuerpo. La intensidad de color es inversamente proporcional a la cantidad de Ag en la muestra Aplicaciones: Determinación de Hormonas, Citoquinas, Drogas, Marcadores Tumorales, etc. Determinación de Gonadotropina Coriónica Humana (h-cg) Captura IgG Antih-CG Marcador Identificado Detección Revelado Agregar Lavado Lavado h-cg Proteínas Recombinantes h-cg Hormona en Suero del Paciente Anti-IgG Conjugados a Enzima Reacción de Color Sustrato Cromógeno Inmunología de Kuby

7 Técnica de ELISA Técnica de ELISA Ventajas Alta sensibilidad y alta especificidad Cuantitativa Relativamente económica Se pueden procesar hasta 96 muestras por placa Gran estabilidad. Limitaciones Positividad Vs. Infección activa: depende del tipo de anticuerpo evaluado. A menos que se evalúe presencia de antígenos en la muestra problema Dificultad de detección de Acs en pacientes con alguna inmunodeficiencia, en período de ventana o infectados por cepas desconocidas.

8 Diagnóstico de la Infección por VIH-1 ELISA

9 Infección por VIH-1 Infección Aguda ARN de VIH-1 p24 de VIH-1 Infección Crónica Anticuerpos anti-vih-1 Ventana de Seroconversión Período de Eclipse Infección por VIH-1 Días de Infección

10 Diagnóstico de Infección por VIH-1 ELISA de 1ra. Generación Captura Marcador Identificado Detección Revelado Ag de VIH-1 Lisado Viral (Cultivo Celular) IgG anti-vih-1 Anticuerpos en Sangre del Paciente Anti-IgG Conjugados a Enzima Reacción de Color Sustrato Apropiado Sensibilidad Limitada Proteínas Celulares Contaminantes Reactividad Cruzada

11 Diagnóstico de la Infección por VIH-1 Infección Aguda ARN de VIH-1 ARN de VIH-1 p24 de VIH-1 Infección Crónica Anticuerpos Anticuerpos anti-vih-1 anti-vih-1 Ventana de Seroconversión Período de Eclipse Infección por VIH-1 Días de Infección

12 Diagnóstico de Infección por VIH-1 ELISA de 2da. Generación Captura Marcador Identificado Detección Revelado Ag de VIH-1/VIH-2 Péptidos Sintéticos Proteínas Recombinantes IgG anti-vih-1/vih-2 Anticuerpos en Sangre del Paciente Anti-IgG Proteína A Conjugados a Enzima VIH-1, VIH-2 Mejora Sensibilidad No Proteínas Celulares Contaminantes Mejora Especificidad Reacción de Color Sustrato Apropiado

13 Diagnóstico de la Infección por VIH-1 Infección Aguda ARN de VIH-1 ARN de VIH-1 p24 de VIH-1 Infección Crónica Anticuerpos Anticuerpos anti-vih-1 anti-vih-1 Ventana de Seroconversión Período de Eclipse Infección por VIH-1 Días de Infección

Diagnóstico de Infección por VIH-1 ELISA de 3ra.

VIH-1/VIH-2 Péptidos Sintéticos Proteínas Recombinantes IgM e IgG

Conjugados a Enzima Reacción de Color Sustrato Apropiado VIH-1, VIH-2

14 Diagnóstico de Infección por VIH-1 ELISA de 3ra. Generación Captura Marcador Identificado Detección Revelado Ag de VIH-1/VIH-2 Péptidos Sintéticos Proteínas Recombinantes IgM e IgG anti-vih-1/vih-2 Anticuerpos en Sangre del Paciente Ag Virales Conjugados a Enzima Reacción de Color Sustrato Apropiado VIH-1, VIH-2 Detecta IgM e IgG Detección más Temprana

15 Diagnóstico de la Infección por VIH-1 Infección Aguda ARN de VIH-1 ARN de VIH-1 p24 de VIH-1 Infección Crónica Anticuerpos Anticuerpos anti-vih-1 anti-vih-1 Ventana de Seroconversión Período de Eclipse Infección por VIH-1 Días de Infección

Diagnóstico de Infección por VIH-1 ELISA de 4ta.

VIH-1/VIH-2 Péptidos Sintéticos Proteínas Recombinantes Ag p24 IgM e IgG

a Enzima Reacción de Color Sustrato Apropiado VIH-1, VIH-2 Detecta Antígeno

16 Diagnóstico de Infección por VIH-1 ELISA de 4ta. Generación Captura Marcador Identificado Detección Revelado E Anti-p24 Ag de VIH-1/VIH-2 Péptidos Sintéticos Proteínas Recombinantes Ag p24 IgM e IgG anti-vih-1/vih-2 Ac y Ag en Sangre del Paciente Anti-p24 Ag Virales Conjugados a Enzima Reacción de Color Sustrato Apropiado VIH-1, VIH-2 Detecta Antígeno Viral (p24) Detecta IgM e IgG Detección más Temprana

Seroconversión Período de Eclipse Infección por VIH-1 Días de Infección Neonatos de

17 Diagnóstico de la Infección por VIH-1 Infección Aguda ARN de VIH-1 ARN de VIH-1 p24 de VIH-1 Infección Crónica Anticuerpos Anticuerpos anti-vih-1 anti-vih-1 Ventana de Seroconversión Período de Eclipse Infección por VIH-1 Días de Infección Neonatos de madres infectadas

18 Diagnóstico de la Infección por VIH-1 WESTERN BLOT

Western Blot Western blot, inmunoblot o electrotransferencia, técnica analítica altamente específica utilizada para identificar proteínas específicas en una mezcla compleja de proteínas, presente en

19 Western Blot Western blot, inmunoblot o electrotransferencia, técnica analítica altamente específica utilizada para identificar proteínas específicas en una mezcla compleja de proteínas, presente en extractos celulares o de tejidos. Etapas: 1. Preparación de la muestra 2. Separación de la muestra por tamaño (Electroforesis en gel de poliacrilamida) 3. Transferencia a un soporte sólido (membrana de nitrocelulosa ) 4. Visualización mediante marcaje de proteínas con el uso de anticuerpos primarios o secundarios apropiados.

20 Western blot Aplicaciones: Investigación: Es una de las técnicas más usadas en el estudio de la biología molecular Permite identificar antígenos inmuno-dominantes para vacunas. Estudiar perfil de citocinas. Presencia o ausencia de una proteína y sus niveles en una muestra. Factores de crecimiento Niveles de fosforilación, modificaciones post-traduccionales, etc. Diagnóstico: Prueba confirmatoria de VIH Prueba de la encefalopatía espongiforme bovina, comúnmente llamada enfermedad de las vacas locas Enfermedad de Lyme.

22 Diagnóstico de la Infección por VIH-1 Algoritmo Recomendado CDC

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