Validación del sistema diagnóstico I-ELISA 3ABC / EITB para uso en la vigilancia de la fiebre aftosa

Transcripción

1 Validación del sistema diagnóstico I-ELISA 3ABC / EITB para uso en la vigilancia de la fiebre aftosa I INTRODUCCIÓN En apoyo a las actividades de vigilancia para evaluar el progreso del programa de erradicación en América del Sur, fue iniciado en 1988 en PANAFTOSA, OPS/OMS, el desarrollo y la validación de enfoques diagnósticos para evaluar actividad viral subclínica de la Fiebre Aftosa en poblaciones animales, independientemente de su estado de vacunación. Todas las etapas para el desarrollo metodológico, estandarización de las características de desempeño y validación fueron posibles gracias a la disponibilidad de un amplio espectro de sistemas de modelos experimentales y de campo. Estos sistemas fueron diseñados con base en nuestra larga experiencia en infecciones persistentes de la Fiebre Aftosa, así como por medio del trabajo en colaboración con los Laboratorios de los Servicios Nacionales de América del Sur. II. CONSIDERACIONES PARA VALIDACIÓN Un importante desafío para la evaluación de las campañas de erradicación de la Fiebre Aftosa está relacionado a la detección de infección subclínica y a su potencial transmisión a hospedadores susceptibles. Por lo tanto, los criterios de validación del presente sistema de diagnóstico fueron dirigidos al establecimiento de las características de desempeño para detección de la actividad viral subclínica en la población, independientemente de la vacunación. Alcanzando estas características, el sistema sería adecuado para confirmar ausencia de actividad viral residual en la población y consecuentemente, para identificar regiones libres de la Fiebre Aftosa, inclusive en condiciones de vacunación sistemática. En este sentido, a) el enfoque debía ser altamente sensible para permitir detectar sueros de bajo título, comunes durante la infección subclínica, especialmente en etapas avanzadas, independientemente de la vacunación. b) era necesario desarrollar un sistema muy específico para evitar distorsión del Valor Predictivo en regiones de baja prevalencia, donde especialmente iría a ser aplicado. Los métodos indirectos no distinguen entre anticuerpos inducidos por infección presente, persistente o pasada. Por lo tanto, la validación fue orientada a detectar la persistencia a nivel de rebaño o población, o sea la presencia de varios portadores o, aún más importante, la posibilidad de transmisión silenciosa de la Fiebre Aftosa por animales infectados subclínicamente dentro y entre rebaños o poblaciones. No se disponía de prueba gold standard, directa o indirecta, para detectar de forma confiable los animales con infección persistente, especialmente en etapas avanzadas. A nivel individual, y por ser un enfoque indirecto, los resultados deben ser considerados con cautela. Eventualmente podrían ser usados como información en apoyo al análisis de riesgo para la importación / exportación de animales. Para vigilancia se espera evaluar un gran número de sueros y por lo tanto, la prueba tenía que ser rápida, práctica, económica y de ejecución sencilla (lo que permite un entrenamiento rápido). Finalmente, para monitorear la ausencia de actividad viral, era conveniente hacer un ensayo inocuo. 1

2 III. ESTRATEGIA El enfoque diagnóstico desarrollado con proteínas no capsidales a ser aplicado en regiones en que se practica vacunación, se basó en un sistema metodológico indirecto, I-ELISA 3ABC como prueba screening, seguido de confirmación de muestras sospechosas por un Western blot (EITB) usando 5 antígenos recombinantes no capsidales como sondas serológicas (3A, 3B, 2C, 3D y 3ABC). Esto nos permitió trabajar en condiciones de alta sensibilidad, sin comprometer la especificidad. Los detalles del ensayo fueron descritos en los documentos 3.3 al Fue preparado un manual completo describiendo el enfoque e interpretación (Doc. 3.11). IV. ENFOQUE PARA VALIDACIÓN Las diferentes etapas están indicadas en el documento 3.2 (Fig. 1). A. ESTANDARIZACIÓN Está descrito en el documento 3.3. B. CARACTERÍSTICAS DE DESEMPEÑO SENSIBILIDAD DIAGNÓSTICA (Doc. 3.3, 3.4, ) INFECCIÓN AGUDA: 100% de sensibilidad (250 sueros). Se incluyeron sueros de animales convalecientes de Fiebre Aftosa, colectados a 20 días del brote y de animales experimentalmente infectados, colectados 20 días después de la infección. Fig. 1 2

3 INFECCIÓN PERSISTENTE: 100% de sensibilidad para los modelos analizados (>230 sueros). Se incluyeron sueros con aislamiento viral positivo a partir del líquido esofágico-faríngeo (LEF). Cabe destacar que las pruebas de aislamiento viral del LEF pueden conducir a resultados falso negativos, especialmente en las etapas tardías de infección persistente (Doc. 3.4). Para superar esta limitación basamos nuestra evaluación en: Sistemas de modelos experimentales (Doc. 3.4, 3.10, 3.11). Fueron analizados sueros de nueve animales no vacunados, con infección persistente establecida en forma experimental, obtenidos secuencialmente a intervalos mensuales, hasta 742 días después de la inoculación. Los resultados de I-ELISA 3ABC / EITB fueron comparados con los obtenidos en la recuperación de virus de los LEF. Los datos indicaron que el sistema es altamente sensible para la detección de animales LEF positivos, mismo en etapas avanzadas de la infección. Resultados similares fueron obtenidos con ocho animales vacunados. Animales Persistentes naturalmente infectados (Doc. 3.10, 3.11 y resultados no publicados). Sueros de 12 animales, con infección persistente confirmada por recuperación viral de LEF a los tres meses después del episodio, fueron analizados secuencialmente en intervalos de tres meses hasta 900 días. Los resultados de I-ELISA 3ABC / EITB fueron comparados con aquellos obtenidos para recuperación viral. Seis de estos animales no mostraron sintomatología clínica. Todas las muestras de animales positivos por aislamiento viral a partir de LEF fueron reactivas en el sistema I-ELISA 3 ABC / EITB. Cabe destacar que una de las muestras que provenía de un animal asintomático, positivo a la prueba de Prabang, resultó positiva al sistema, aunque con título relativamente bajo, confirmando la importancia de emplear una prueba de alta sensibilidad. ESPECIFICIDAD DIAGNÓSTICA (Doc. 3.3, 3.4, ) Para el I-ELISA 3ABC fue obtenida una especificidad de 99.2%. El uso de la prueba EITB como confirmatoria resultó en una especificidad de 100%, demostrando así la importancia del uso de la misma para la confirmación de muestras reactivas en el I-ELISA 3ABC. Se evaluaron más de sueros negativos verdaderos. Fueron incluidas muestras de países libres de Fiebre Aftosa sin vacunación y sueros de animales destinados a pruebas de potencia de vacuna, sin registro de exposición al virus de la Fiebre Aftosa y sin vacunación contra dicha enfermedad. La respuesta de los sueros de animales infectados con una variedad de virus bovinos a RNA y DNA indicó ausencia de reactividad cruzada. REPRODUCTIBILIDAD (Doc. 3.7 y 3.11) Se obtuvieron resultados satisfactorios en pruebas de variación intra e inter ensayo usando muestras débilmente positivas. INTERFERENCIA POTENCIAL DE VACUNA (Doc. 3.4, e informes internos) Se demostró ausencia de interferencia a los 30 días de la inmunización con vacunas experimentales y/o comerciales (aproximadamente sueros), aún bajo condiciones que llevan a un aumento de la respuesta inmune (vacunas altamente concentradas y/o programas de inmunización más cortos) (250 animales). C. HABILIDAD DEL SISTEMA PARA CONFIRMAR AUSENCIA DE ACTIVIDAD VIRAL EN POBLACIONES DE ANIMALES VACUNADOS El sistema I-ELISA 3ABC / EITB fue desarrollado como instrumento para monitorear la infección residual subclínica del virus de la Fiebre Aftosa en áreas con avanzadas campañas de erradicación, en las cuales se 3

4 espera una alta cobertura inmunológica. En este sentido, fueron enfocados muestreos que representaran la situación de campo para establecer si el sistema era adecuado para confirmar la ausencia de actividad viral en la población como un todo. Con esta finalidad evaluamos: PERSISTENCIA DE ANTICUERPOS DESPUÉS DE LOS BROTES (Doc y 3.11) Se estudiaron 40 bovinos de una propiedad en la que ocurrió un brote después de haber estado libre de Fiebre Aftosa por lo menos en los seis años anteriores. La población había sido y continuaba siendo vacunada en forma sistemática cada seis meses. Veinte de las muestras provenían de animales con enfermedad clínica. Los perfiles de anticuerpos observados a los 90 y 900 días post foco (DPF) se encuentran en el Doc Independientemente de la vacunación, la prueba permitió analizar la situación de infección en el rebaño. A partir del episodio se constató una clara transición de los resultados positivos a negativos en función del tiempo. Sin embargo, sueros reactivos aún fueron detectados en aproximadamente 8% de la población a 900 DPF, aunque la última recuperación de virus en la población ocurrió a los 270 DPF. RESPUESTA DE ANTICUERPOS EN REGIONES A 4-5 AÑOS DESPUÉS DE LOS ÚLTIMOS EPISODIOS A. Se realizó la evaluación de sueros de animales vacunados de diferentes regiones sin registro de Fiebre Aftosa por lo menos en los 4 a 5 años anteriores a la colecta de las muestras (Doc. 3.10). Solamente 0.026% y 0.3% de los animales menores y mayores de dos años de edad, respectivamente, fueron reactivos en el sistema. El porcentaje relativamente bajo de muestras seropositivas en los animales más jóvenes sugirió que, por lo menos durante los últimos dos años, el virus no circulaba en la población. B. Resultados similares fueron obtenidos para 2.l94 muestras de sueros utilizadas para confirmar ausencia de actividad viral en Uruguay, en las que no se registraron resultados positivos en la población de <2 años (Doc. 3.5). Con base en los resultados mencionados, podemos concluir que: El sistema tiene suficiente sensibilidad para detectar animales persistentemente infectados. Cicatrices de anticuerpos aún pueden ser detectadas a 630 días después de la última recuperación del virus. Para evaluar actividad viral, la correcta interpretación de los muestreos debe considerar los animales nacidos después de los últimos episodios como indicadores inequívocos, por lo menos desde el momento en que nacieron, de ausencia de actividad viral en la población, independientemente de la vacunación. En consecuencia, el análisis de los resultados deberá considerar la distribución por edad. D. PERFILES DE ANTICUERPOS I-ELISA 3ABC COMO INSTRUMENTO DE VIGILANCIA Los perfiles de reactividad del I-ELISA 3ABC fueron estimados como un complemento para evaluar la actividad viral en diferentes situaciones de campo: a) Áreas libres de Fiebre Aftosa sin vacunación (Gráfico 2A; n ~ 9000 sueros) b) Regiones sin brotes por lo menos durante los últimos cuatro años, bajo vacunación sistemática (Gráfico 2B; n ~ sueros) 4

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6 c) Seguimiento de brotes (Gráfico 3A; n ~ 120 sueros) d) Áreas con actividad viral confirmada (Gráfico 3B; n ~ 4000 sueros) e) Brotes (Gráfico 3C; n ~ 150 sueros) La distribución fue dividida en las siguientes categorías de reactividad: Neg.1: T/C 0.3 Pos. 1: T/C 1.0 y < 2.0 Neg.2: T/C > 0.3 y 0.7 Pos. 2: T/C 2.0 y 5.0 Neg.3: T/C > 0.7 y < 1.0 Pos. 3: T/C >5.0 Los resultados indican claramente la importancia del uso de gráficos de perfiles de reactividad de anticuerpos para una visualización rápida de las diferentes situaciones epidemiológicas, independientemente de la vacunación. 6

7 E. EXTENSIÓN DE LOS CRITERIOS DE VALIDACIÓN ESTUDIO DE VARIABLES QUE PODRÍAN AFECTAR EL DESEMPEÑO DEL SISTEMA SERODIAGNÓSTICO: DIFERENTES PROTOCOLOS DE PRODUCCIÓN DE VACUNA Los métodos de purificación y concentración utilizados en la preparación de vacunas en laboratorios de América del Sur pueden variar mucho. En efecto, un episodio aislado de interferencia ha sido registrado en algunas partidas de un laboratorio. Esta interferencia se supera cuando se aplican esquemas apropiados de purificación durante el proceso de producción de vacuna. Debido a esta observación, actualmente se están realizando estudios con vacunas de varios fabricantes en América del Sur. Las reactividades en sueros fueron evaluadas a los 28 días post vacunación en más de animales, algunos sometidos a esquemas de revacunación. Las vacunas modernas pueden incluir procedimientos más elaborados para la concentración y purificación del antígeno y por lo tanto, es aconsejable una evaluación continua de la interferencia potencial de las vacunas en el campo, pudiendo ser evaluadas y controladas con pruebas de calidad adecuadas. Estos ensayos están siendo desarrollados en PANAFTOSA. PRUEBAS EN OTROS HOSPEDADORES Una estrategia equivalente ha sido empleada para: ovejas, cabras, búfalos y cerdos. VALIDACIÓN EN OTROS LABORATORIOS DE REFERENCIA DE LA OIE Fue realizada en el: Laboratorio Mundial de Referencia de la Fiebre Aftosa (Pirbright, Reino Unido) (Doc. 3.12) Laboratorio Nacional Italiano de Referencia de la Fiebre Aftosa en Brescia (Doc. 3.12) USO EN GRAN ESCALA Transferencia del sistema y utilización en gran escala en los siguientes Laboratorios Nacionales de Referencia sudamericanos: ARGENTINA-SENASA BRASIL-LARA-POA BRASIL-LAPA-RECIFE COLOMBIA ECUADOR-INH ECUADOR-SESA -ICA PARAGUAY-SENACSA PERÚ-INS PERÚ-SENASA URUGUAY-DILAVE VENEZUELA-SASA-INIA-IIV 7

8 Algunos de los resultados obtenidos contribuyeron al apoyo de los requisitos de OIE para el reconocimiento de áreas libres con o sin vacunación y sirvieron como información en la evaluación de análisis de riesgo durante pruebas para importación / exportación. El uso de estas pruebas ha superado las determinaciones en los países antes mencionados, solamente en el año 2000 (Fig. 4). CONTROL DE CALIDAD Y ARMONIZACIÓN Desde el comienzo fueron considerados aspectos de calidad, incluyendo la evaluación de reproductibilidad intra e inter ensayos, así como entre laboratorios. Los sueros de control de referencia son incluidos en todos los geles y en cada placa ELISA (positivo fuerte, positivo, positivo débil, control límite ( cut-off ), y negativo). El origen de los sueros está descrito en el Doc Esos sueros son estandarizados en PANAFTOSA y suministrados a los países. Una vez al año PANAFTOSA realiza el control de calidad externo de los Servicios Nacionales en América del Sur. 8