RESULTADOS Y DISCUSIÓN. Purificación de Tripsina

Transcripción

1 RESULTADOS Y DISCUSIÓN Purificación de Tripsina La enzima, necesaria para estandarizar el método de ELISA y el ensayo de manchas, se obtuvo mediante 4 etapas de purificación a partir de 100 g de ciegos pilóricos. La tripsina fue separada del resto de las moléculas del extracto crudo mediante cromatografía de exclusión molecular; las fracciones con mayor actividad enzimática fueron colectadas y se hicieron pasar por una columna de intercambio iónico. El extracto crudo (ciegos pilóricos homogenizados con el buffer de extracción) con un volumen total de 240 ml, 870 mg de proteína total y una concentración de 4 mg/ml, tuvo una actividad específica tipo tripsina de 0.4 U/mg, que fue significativamente menor a la actividad de los extractos obtenidos por Castillo-Yáñez y col., en el 2004 (de 0.5 U/mg). En la etapa final de purificación de la enzima, se obtuvo una actividad tipo tripsina de 3 U/mg (8 veces mayor que la actividad inicial), con el 5% de recuperación de proteína en 5 ml totales, con una concentración de 1 mg/ml. Estos valores son semejantes a los reportados en el 2004 por Castillo-Yáñez y colaboradores. En la Tabla IV se muestra el resumen del proceso de purificación de la tripsina, y en la Figura 4 se puede apreciar el perfil electroforético característico de la enzima, bajo condiciones desnaturalizantes; con una banda de aproximadamente 25 kda, 44

2 que corresponde al monómero de tripsina y una banda de aproximadamente 62 kda que corresponde al dímero de la misma enzima. Este perfil es similar al reportado por Castillo-Yáñez en el Sin embargo el porcentaje de recuperación de la enzima obtenido de las fracciones con sulfato de amonio comparado con el proceso final de purificación, que es la cromatografía de intercambio iónico es 7 veces menor, lo cual puede traducirse en que la cantidad de proteína obtenido en cuatro etapas es muy poco a pesar de tener mayor actividad tipo tripsina a diferencia de las fracciones provenientes del sulfato de amonio, además de obtener solo 1 mg de proteína por cada mililitro a después de haber iniciado con 87 mg de proteína total. Este rendimiento y recuperación proteica se puede decir que es muy bajo lo cual representa gran desventaja el utilizar este proceso de purificación y por tal motivo se cree que es de gran importancia contar con los anticuerpos monoclonales para tripsina para lograr crear una cromatografía de afinidad biológica que a su vez permitiría aumentar los rendimientos proteicos y por ésta misma razón es indispensable estandarizar el ensayo de ELISA así como el ensayo de Manchas ya que son indispensables en el tamizaje y amplificación en la generación del hibridoma. 45

3 Tabla IV. Valores de proteína y actividad enzimática obtenidos en el proceso de purificación de tripsina. Etapa de purificación Volumen total (ml) Proteína total (mg) Proteína (mg/ml) A. T. (U) A.E. (U/mg) Aumento en A.E. % Recuperación Extracto crudo Fracción con S.A. Filtración en gel: Sephadex G-75 Intercambio Iónico U= µmol de nitroanilina por minuto S.A.= sulfato de amonio A.T.= actividad total A.E.= actividad específica 46

4 Carril Figura 4. Electroforesis en condiciones desnaturalizantes, al 12% de acrilamida, de las fracciones proteicas obtenidas en cromatografía de intercambio iónico. En el carril 2 y 9 se tienen los marcadores de masa de amplio rango, en los carriles 4 y 7 se tienen mezclas de fracciones provenientes de cromatografía de intercambio iónico las cuales contienen una banda de aproximadamente 25 kda (monómero de tripsina) y una banda de aproximadamente 62 kda (el dímero de la enzima). 47

5 Estandarización de Métodos Inmunoenzimáticos (ELISA y Dot-Blot) para la Evaluación de la Respuesta Inmune Humoral Murina Frente a Tripsina Inmunoensayo Absorbente Ligado a Enzimas (ELISA) Con el fin de estandarizar el ensayo inmunoenzimático en placa para la evaluación de la respuesta inmune humoral frente a tripsina, se inmunizaron 3 ratones C3H/HeJ con tripsina pura, además se utilizaron los sueros preinmunes así como los sueros correspondientes a la tercera inmunización (tercera semana de reto con tripsina). Se realizó el ensayo de ELISA indirecto, utilizando de manera inicial 2 µg de la enzima (antígeno) y una dilución constante del anticuerpo secundario (antisuero de cabra anti-igg de ratón 1:2,000). En la Figura 5 se puede observar que el incremento en la D.O. a 415 nm, entre los sueros pre-inmunes y los sueros post-inmunes (obtenidos tras el tercer refuerzo) fue de hasta 11 veces mayor para los sueros postinmunes, lo cual es una demostración de la presencia de anticuerpos anti-tripsina en el suero de los ratones. Además, en la misma figura se puede observar que con 2 µg de la enzima se detectaron anticuerpos en el suero murino hasta en una dilución 1:1,000, lo cual nos indica la especificidad del anticuerpo generado contra epítopes de la enzima. Los datos obtenidos en la estandarización de este método son similares a los reportados con otras proteínas, por ejemplo con las 48

6 proteínas de parásitos de G. lamblia, ya que con el ELISA se detecta un incremento en la producción de anticuerpos de tipo IgG, desde la segunda semana, utilizando la misma cantidad de antígeno pero con una ligera modificación en la dilución del anticuerpo secundario (1:1,000) (Velázquez y col., 2005). D.O 415 nm :50 1:200 1: R1/S1 R2/S1 R3/S1 R1/S3 R2/S3 R3/S3 P R E IN M U N IZAC IO N P O S T IN M U N IZAC IO N R1/S1= Ratón número 1, suero número 1 o pre-inmune R2/S1 = Ratón número 2, suero número 1 o pre-inmune R3/S1 = Ratón número 3, suero número 1 o pre-inmune R1/S3= Ratón número 1, suero número 3 o post-inmune R2/S3 = Ratón número 2, suero número 3 o post-inmune R3/S3 = Ratón número 3, suero número 3 o post-inmune Figura 5. Evaluación de la respuesta inmune humoral anti-tripsina en ratón mediante ELISA (indirecto). En este ensayo se detectó la presencia de anticuerpos séricos anti-tripsina en los ratones utilizando 2 µg de la enzima (antígeno) utilizando una dilución constante del 49

7 anticuerpo secundario (anticuerpo de cabra anti-igg de ratón), además se utilizaron los sueros pre-inmunes de cada uno de los ratones (R1/S1/R2/S1/R3/S1) así como los sueros post-inmunes correspondientes a la tercera semana de inmunización (R1/S3/R2/S3/R3/S3) en diluciones de 1:50, 1:200,1:600 y 1:1,000. Una vez detectada la presencia de anticuerpos dirigidos contra tripsina en el suero de los ratones, se continuó con la estandarización del método de ELISA indirecto. Para lograr estandarizar ésta metodología se evaluaron los siguientes parámetros: cantidad de antígeno o tripsina a partir de 0.0 hasta 2.5. µg por pozo y dilución del anticuerpo primario (-), tanto para los sueros pre-inmunes como para los sueros post-inmunes. En la Tabla V se muestran los resultados obtenidos en este ensayo; para el caso de los sueros postinmunes se observó claramente una diferencia en las densidades ópticas obtenidas para cada dilución del suero con respecto a las cantidades de antígeno, ya que conforme aumentó la dilución del suero disminuyó la D.O, sin embargo se logra detectar la mínima cantidad de antígeno adsorbido en la placa que es de 0.25 µg inclusive con una dilución del suero de hasta 1:4,000, lo cual indica una respuesta humoral murina intensa (Figura 6). Los datos obtenidos se pueden comparar con ensayos llevados a cabo con tripsina canina, ya que utilizando 0.1 µg de esta enzima se ha logrado desarrollar un sistema que evalúa la inmunoreactividad de tripsina con anticuerpos monoclonales para detectar insuficiencia pancreática en caninos (Waritani y col., 2002). En la detección de anticuerpos contra distintas proteínas en peces se pueden mencionar los resultados obtenidos por Aguillón en 1997, ya que en su objetivo por obtener anticuerpos policlonales (antiinmunoglobulinas de salmón), reporta la capacidad de los anticuerpos generados (en títulos de hasta 1:100,000) de reconocer 0.02 µg de antígeno (Ig de Salmón) lo cual nos indica 50

8 que el sistema inmune de los peces está tan bien desarrollado como el de los vertebrados superiores. Con los resultados anteriores, se sugirió que la cantidad de antígeno recomendable (cualitativamente) podría estar entre 0.5 y 2 µg por pozo, con una dilución del suero post-inmune entre y 1:1,000; estos datos se resaltan de color rojo en la Tabla IV. Tabla V. Determinación de la cantidad de antígeno (tripsina) para la técnica de ELISA. Dilución de Suero Post-inmune Dilución de Suero Pre-inmune Ag µg/50µl * * 0.402* * * 0.378* * * 0.332* * = en rojo aquellos resultados (D.O.) considerados como óptimos para éste sistema. 51

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10 ELISA con 2.5µg de Tripsina ELISA con 2.0 µg de Tripsina D.O 415 nm Sueros Post-Inmunes Sueros Pre-inmunes a) 2.5 µg Tripsina b) D.O 415 nm Sueros Pre-Inmunes Sueros Post-Inmunes 2.0 µg Tripsina D.O 415 nm D.O. 415 nm ELISA con 1.0 µg de Tripsina 0.0 Sueros Post-Inmunes Sueros Pre-Inmunes 1.0 µg de Tripsina c) d) ELISA con 0.25 µg de Tripsina 0.0 Sueros Post-Inmunes Sueros Pre-Inmunes e) f) 0.25 µg de Tripsina D.O 415 nm D.O. 415 nm ELISAcon 0.5 µg de Tripsina 0.0 Sueros- Post-Inmunes µg de Tripsina Sueros Pre-Inmunes ELISA con 0.0 µg de Tripsina 0.0 Sueros Post-Inmunes Sueros Pre-Inmunes 0.0 µg de Tripsina 1: 1000 Figura 6. Título de anticuerpos anti-tripsina con diferentes cantidades de tripsina utilizando la técnica de ELISA (indirecto). Para el ensayo se utilizaron diluciones de los sueros pre y post-inmunes de a y las cantidades de tripsina variaron de 0.0 a 2.5 µg, representadas en cada inciso. 53

11 Los resultados de los ensayos finales demostraron que utilizando 1 µg de tripsina y diluciones del suero de la séptima semana de inmunización de 1:1,000 hasta 1: 16,000, se obtienen señales de D.O. adecuadas, tal como se demuestra en la Tabla VI. Lo anterior, nos indica que el sistema inmunitario de los ratones ha sido capaz de generar una memoria frente a la tripsina (Figura 7). 54

12 Tabla VI. Titulación del suero (anticuerpos anti-tripsina) mediante ELISA. Dilución del Suero 1:8000 1:16000 Suero post-inmune Suero pre-inmune Se presentan las D.O. obtenidas utilizando 1 µg de tripsina con diluciones seriadas de los sueros pre y post inmunes, en donde se observa la presencia de anticuerpos hasta en una dilución de 1:16,000 a diferencia del suero pre-inmune. 55

13 D.O. 415 nm Título de Anticuerpos anti-tripsina 1:8000 1:16000 D.O. 415 nm Título de Anticuerpos anti-tripsina 1:8000 1: Dilución de Sueros Post-Inmunes a) b) Dilución de Sueros Pre-Inmunes Figura 7. Título de anticuerpos anti-tripsina mediante ELISA indirecto. En la figura a) y b) se presentan los títulos obtenidos para los sueros post-inmunes y pre-inmunes respectivamente, en donde se observa la diferencia en producción de anticuerpos debido a cada reto suministrado; en éste caso corresponde al séptimo reto. Las diluciones del suero fueron de 1:1,000 a 1:16,000. EL anticuerpo secundario se utilizó en una dilución 1:2,

14 Ensayo de Manchas (Dot-Blot) Se establecieron las condiciones experimentales para el ensayo de manchas, evaluando distintas diluciones tanto de los sueros pre-inmunes como de los sueros post-inmunes, acoplando 1.6 µg de tripsina a la membrana de nitrocelulosa tal y como se plantea en la metodología. De acuerdo a lo anterior se tituló el suero del ratón (Figura 8), observándose un ligero efecto de fondo en una dilución de 1:2,000 para el caso de los sueros preinmunes que pudo deberse a la manipulación del suero ya que no se observa en comparación con el control negativo, el cual tiene acoplada la enzima a la membrana y como suero PBS. Sin embargo en el caso de los sueros positivos claramente se evidencia la interacción antígeno-anticuerpo, lo cual nos demuestra una vez más la presencia de anticuerpos dirigidos a ciertas determinantes antigénicas de tripsina, aún en una dilución de 1:4,000, sobre todo en las diluciones más concentradas ( y 1:1,000); esto se corrobora al comparar con la señal generada por los sueros preinmunes en las mismas diluciones, y el control negativo (PBS). Con base en lo descrito anteriormente, las condiciones óptimas para la inmunodetección de anticuerpos anti-tripsina son las siguientes: 1.6 µg de antígeno, una dilución de o para el caso del suero y una dilución en 1:10,000 para el anticuerpo secundario. Los datos obtenidos en este ensayo son similares a los reportados para otras proteínas, como péptidos de proteínas vegetales, los cuales son reportados por Torres y col., en el 2003, quienes utilizan 1 µg como antígeno; sin embargo, esa cantidad provocó reacciones inespecíficas con el suero preinmune evidenciando efectos de fondo en la mayoría de las diluciones evaluadas, en nuestro caso 1.6 µg de la enzima provocó un ligero efecto de fondo solo en la dilución de 1:2,000 del suero preinmune, a la vez existen resultados para enzimas como la iduronato-2-sulfato sulfatasa (IDS) (Peña y col., 2005) en donde al evaluar anticuerpos contra la misma enzima mediante el ensayo de manchas utilizan cantidades hasta 3 veces más pequeñas que la utilizadas en este trabajo; 57

15 y este tipo de variaciones pueden deberse al tipo de enzima utilizada así como a los antisueros que se evaluaron, entre otras características.. 58

16 Figura 8. Determinación del título de anticuerpos anti-tripsina mediante el ensayo de manchas. Las diluciones de los sueros fueron seriadas de a 1:16,000. El anticuerpo secundario se utilizó en una dilución 1:10,