Presencia de glicoproteínas del virus del PRRS en el antígeno de un ELISA Indirecto. Utilidad y Significado.

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1 Presencia de glicoproteínas del virus del PRRS en el antígeno de un ELISA Indirecto. Utilidad y Significado. Sitjà, M.; Medrano, A.; Busquets, Caballero, J. P.; Artigas C. Laboratorios HIPRA, S.A. Avda. La Selva, Amer (Girona) España INTRODUCCIÓN El síndrome reproductor y respiratorio porcino (PPRS) es una enfermedad causada por un virus de la família Arteriviridae. La estructura del virus del PRRS consiste en una envuelta lipoglicoproteica que envuelve una cápside isométrica, dentro de la cual se encuentra el material genético. El genoma de PRRS es un RNA de cadena sencilla y de polaridad positiva de alrededor de 15 Kba. La envuelta tiene un composición compleja y en ella se encuentra la proteína M o de la matriz y 4 glicoproteínas diferentes (GP2, GP3, GP4 y GP5) siendo GP5 la glicoproteína mayoritaria. La cápside está formada exclusivamente por proteína N o proteína de la nucleocápside 1. GP2 GP3 GP4 N GP5 M Figura 1. Representación esquemática de la estructura del virus del PRRS. El diagnóstico de las infecciones causadas por el virus PRRS se puede realizar mediante la detección de la presencia del virus o mediante el estudio de la presencia de anticuerpos específicos frente a epítopos de su estructura. Las técnicas de detección del agente viral utilizadas son RT-PCR (retrotranscripción y reacción en cadena de la polimerasa), aislamiento del virus, immunohistoquímica e hibridación in situ de tejidos. Actualmente, se está utilizando cada vez más la detección mediante RT-PCR debido a que es rápida, específica y muy sensible. Las técnicas serológicas más utilizadas para la detección de anticuerpos específicos frente al virus PRRS son IFI (inmunofluorescencia indirecta) en Norte América, IPMA (immunoperoxidasa en monocapa de macrófagos) en Europa y ensayos ELISA (enzimoinmunoensayo indirecto) de bloqueo o indirecto. Otro método serológico es el ensayo de neutralización del virus (VN), siendo la única técnica que permite detectar específicamente la presencia de anticuerpos neutralizantes del virus, sin embargo, es el menos utilizado porque resulta relativamente caro, es complicado y requiere más tiempo y manipulación. Se ha determinado que la respuesta humoral de los cerdos infectados con el virus PRRS es compleja y se originan anticuerpos capaces de reconocer específicamente las diferentes proteínas estructurales del virus: la proteína M, la proteína N y las glicoproteínas de la envuelta. Los anticuerpos neutralizantes frente al virus del PRRS son los generados contra epítopos presentes en las glicoproteínas expuestas en la membrana vírica, principalmente frente a la

2 GP5 2, estos anticuerpos son de aparición tardía pudiendo generarse a partir de las 3 semanas post-infección. Debido a que la técnica ELISA posee una serie de ventajas respecto a la seroneutralización, sería interesante disponer de un método de ELISA indirecto informativo respecto a la presencia de estos anticuerpos neutralizantes. El Western blot es otra técnica serológica que se utiliza esporádicamente como herramienta de investigación de los supuestos falsos positivos en otras técnicas serológicas. La visualización de las bandas específicas correspondientes a las proteínas virales permite confirmar la positividad de los sueros 3. En el presente trabajo se pretende relacionar la seroconversión tras una infección, detectada por un ensayo ELISA, con el seroperfil obtenido por Western blot. En ambos casos se utilizan como antígeno las glicoproteínas de la envuelta vírica. También se analiza el posible uso del Western blot para el análisis de las discrepancias entre métodos serológicos. MATERIAL Y MÉTODOS Infección experimental Para este estudio se utilizaron 6 cerdos de una granja libre de PRRS. Se infectaron cuatro con 2 ml de 10 5,5 DICT 50 /ml de virus de PRRS variante europea por vía intranasal. Los otros 2 animales se utilizaron como controles y se inocularon con PBS por la misma vía. Se realizaron extracciones de sangre los días 0, 2, 5, 7, 9, 12, 14, 16 y 19 post-infección. Análisis serológico por ELISA Para el análisis serológico se utilizó un enzimoinmunoensayo indirecto específico para la detección de anticuerpos específicos frente a la variante europea del virus de PRRS 4. Se incubaron los sueros diluidos 1:200 durante 1h a 37ºC sobre placas tapizadas con proteínas solubilizadas del virus de PRRS. Se lavaron los pocillos y se añadió anticuerpo monoclonal conjugado a peroxidasa específico contra anticuerpos porcinos o proteína A conjugada también con peroxidasa. Se incubó 1h a 37ºC. Posteriormente, se lavó el exceso de conjugado y se añadió un substrato de la peroxidasa (TMB). Después de una incubación de 10 min a temperatura ambiente se detuvo la reacción y se leyó la densidad óptica (DO) a 450 nm. Para la interpretación de los resultados se obtuvo el valor de IRPC (Índice Relativo x100) de cada muestra: DO450Muest ra Media DO450 Control Negativo IRPC = x 100 Media DO450 Control Positivo Media DO450 Control Negativo Se consideró una muestra negativa cuando el valor de IRPC era igual o inferior a 20. Análisis serológico por Western blot Se separaron las proteínas del virus del PRRS mediante SDS-PAGE al 15% y se electrotransfirieron a una membrana de PVDF. Después de una saturación con 3% leche en polvo en PBS tween %, se cortaron las membranas y se incubaron 2h a temperatura ambiente con los sueros de las diferentes extracciones de un animal infectado o con el suero de un animal discrepante a dilución 1:100 en 3% leche en polvo en PBS tween %. Posteriormente se lavaron las membranas con PBS tween, y se incubaron con un anticuerpo monoclonal conjugado a peroxidasa específico frente a las IgGs porcinas, 1h a temperatura ambiente. A continuación se lavó el exceso de conjugado con PBS tween % y se revelaron las membranas con un kit comercial de substrato de peroxidasa (OPTI-4CN Substrate Kit, Bio-Rad).

3 RESULTADOS Y DISCUSIÓN Seroconversión tras la infección experimental La evaluación de la infección experimental se realizó con el análisis serológico por ELISA de las extracciones seriadas de los 4 animales infectados y los 2 animales control. Los resultados obtenidos están representados en la Figuras 2 y 3. La infección experimental se produjo correctamente ya que en los 4 animales infectados se detectó, mediante RT-PCR, la presencia del virus en sangre a los 2 días post-infección. El ELISA que detecta específicamente las IgG porcinas permitió detectar la seroconversión en dos de los animales infectados a los 12 días post-infección, siendo positivos a los 14 días post-infección todos los animales infectados. Si en vez de utilizar el anticuerpo monoclonal anti-igg porcinas se utiliza proteína A conjugada se observa que la seroconversión se detecta a los 9 días post-infección debido al reconocimiento parcial de las IgM porcinas por parte de la proteína A. Aunque la proteína A permite en detección precoz de la respuesta humoral se ha comprobado que genera resultados menos específicos. Los resultados muestran que el ELISA permite la cuantificación de la aparición progresiva, post-infección, de los anticuerpos específicos contra el virus del PRRS. Además también se observa que utilizando un único tipo de antígeno en función de la población de anticuerpos que se analizan la precocidad de detección de la infección es diferente. IRPC días post-infección _ infectados _ controles _ punto de corte Figura 2: Perfil de seroconversión determinado por ELISA utilizando anticuerpo monoclonal específico para IgG porcinas. Los resultados se expresan en valor IRPC del resultado del ELISA.

4 IRPC _ infectados _ controles _ punto de corte días post-infección Figura 3: Perfil de seroconversión determinado por ELISA utilizando Proteína A conjugada. Los resultados se expresan en valor IRPC del resultado del ELISA. Especificidad de la seroconversión Se analizó por Western blot el seroperfil frente al virus de PRRS de 5 sueros correspondientes a las extracciones de los días 0, 9, 14, 16 y 19 post-infección ( ). Como conjugado en el Wetern blot se utilizó el monoclonal específico frente a IgG porcinas. Los resultados indicaron que a partir del día 9 post-infección es posible detectar anticuerpos frente a la proteína de membrana no glucosilada del virus de PRRS (19KDa) 5 y que estos anticuerpos continúan presentes a los 19 días post-infección. Además, a partir del día 14 post-infección se detectaron anticuerpos frente a las glicoproteínas del virus del PRRS (25-32KDa) 2 de las cuáles se conoce que la más abundante es la GP5 (25KDa) 5. La no detección de respuesta específica frente a la proteína de nucleocápside (15KDa) 5 es una evidencia indirecta de su baja proporción en el antígeno utilizado, ya que está descrito que cuando se utilizan extractos virales completos los anticuerpos que reconocen la proteína N se detectan con más precocidad respecto a los que reconocen las glicoproteínas MK D0 D9 D14 D16 D Figura 4: Especificidad proteica post-infección determinada por Western blot. Se analizaron por Western blot 5 sueros correspondientes a la diferentes extracciones de un mismo animal a diferentes días post-infección con el virus del PRRS (D0, D9, D14, D16 y D19: 0, 9, 14, 16 y 19 días post-infección respectivamente).

5 Los resultados indican que la seroconversión determinada por un ELISA que presenta glicoproteínas del virus del PRRS en el antígeno, corresponde con una respuesta específica frente a estas proteínas. El presente Ag está formado por todas las proteínas de la membrana del virus del PRRS, incluyendo la GP5 que permite la detección de la respuesta seroneutralizante 1,2 y la proteína de membrana no glucosilada, que permite una detección precoz de la seroconversión respecto a la que se consigue con las glicoproteínas. Este antígeno, en contraposición a lo aportado por un antígeno basado únicamente en la proteína de la nucleocápside, proporcionaría información correlacionable con la presencia de respuesta seroneutralizante. La técnica de Western blot es una herramienta que permite de manera puntual investigar los supuestos falsos positivos en los métodos serológicos. Por ejemplo, se analizó por Western Blot un suero porcino discrepante entre un ELISA basado en la nucleocápside del virus y otro que, entre otras proteínas, contiene glicoproteínas en su composición, el resultado obtenido en los ELISAs fue negativo y positivo respectivamente. La figura 4 muestra los resultados obtenidos en el Western blot. Se observó que dicho suero (C-1) tenía reactividad específica contra las glicoproteínas presentes en el antígeno, por lo que indica que dicha cerda ha estado en contacto con el virus del PRRS y que presenta anticuerpos específicos frente a éste. MK D0 D16 C Figura 5: Especificidad de la respuesta obtenida con el ELISA determinada por Western blot. Se analizaron por WB tres sueros porcinos: D0 suero correspondiente al día 0 de la infección experimental, D16: suero porcino 16 días post-infección con el virus del PRRS y C-1: suero porcino discrepante entre ELISA de nucleocápside y ELISA con glicoproteínas en su antígeno. En el carril de MK se cargaron los marcadores de pesos moleculares. CONCLUSIONES El ELISA permite la cuantificación de la aparición progresiva, post-infección, de los anticuerpos específicos contra el virus del PRRS. En función de la población de anticuerpos que se analizan, cuando se utiliza un único tipo de antígeno, la precocidad de detección de la infección es diferente. El uso de proteína A como conjugado en un ELISA permite detectar la seroconversión post-infección de manera más precoz respecto a un conjugado que sólo detecta IgG. El uso de un ELISA que presente cómo antígeno extracto vírico con la presencia de glicoproteínas en su composición permite una aproximación más real del conocimiento de la evolución de los anticuerpos frente al virus PRRS.

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