RESULTADOS Y DISCUSIÓN. Estimación de la Concentración Proteica del Filtrado de Cultivo de Mycobacterium tuberculosis H37Rv

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1 RESULTADOS Y DISCUSIÓN Estimación de la Concentración Proteica del Filtrado de Cultivo de Mycobacterium tuberculosis H37Rv La curva estándar con la que se estimó la concentración proteica del filtrado de cultivo tuvo un coeficiente de regresión lineal de Con esta curva se estimó la concentración de proteína en el cultivo de Mycobacterium tuberculosis filtrado (sin células), obteniéndose una concentración promedio de 0.4 mg/ml de cultivo; este es un rendimiento superior al que se obtuvo en un trabajo similar realizado por Bolado-Martínez (2003) con medio M7H9, que fue de 1.5 x 10-3 mg/ml, debido a que en este último se utilizaron volúmenes menores de medio de cultivo (de 40 ml) y los recipientes no permitían el ingreso de aire al medio de cultivo. Electroforesis de Filtrado de Cultivo El análisis electroforético en SDS-PAGE al 15% de filtrado de cultivo de Mycobacterium tuberculosis H37Rv mostró la presencia de 19 bandas proteicas, con masas moleculares relativas que van desde los 13 hasta los 93 kda (Figura 5). Entre las bandas, se encuentran algunas que han sido asociadas con proteínas inmunodominantes, tales como las del complejo ag85, de 30/32 kda (Wiker y col., 1992), la proteína de 38 kda (Ramírez y col., 2002) y la de 19 kda (Ramírez y col., 2002). 24

2 Carriles kda 1 2 kda Figura 5. Perfil electroforético del filtrado proteico obtenido de un cultivo de Mycobacterium tuberculosis H37Rv en Middlebrook 7H9, de 8 semanas. Carril 1. Marcador de peso molecular, Carril 2. Proteínas de filtrado de cultivo. 25

3 Estandarización del Método de Electrotransferencia e Inmunodetección (Western blot) En este trabajo se ensayaron dos esquemas para la estandarización del método de electrotransferencia e inmunodetección, para identificar antígenos del filtrado de cultivo líquido en M7H9 de Mycobacterium tuberculosis H37Rv, reactivos hacia anticuerpos presentes en el suero de una persona sin tuberculosis con reacción positiva al PPD y un suero de una persona con tuberculosis activa. Identificar la cantidad de antígeno óptima para un ensayo de inmunodetección es un proceso que implica la fijación de cantidades variables del antígeno, rangos que van de los nanogramos a los microgramos, sin embargo, es importante considerar la información basal publicada en artículos en los que se describe el rango utilizado en el caso de proteínas micobacterianas (Landowski y col., 2001). Además, se sabe que el Western blot es un método de alta sensibilidad (www.cultek.com/inf/otros/soluciones/cultek-tecnicawb.pdf), por lo que en este trabajo el proceso de estandarización del Western blot inició corriendo el SDS-PAGE aplicando por pozo cuatro diferentes concentraciones del antígeno (proteína de filtrado de cultivo de Mycobacterium tuberculosis H37Rv): 80, 120, 130 y 190 µg/100 µl. Los geles SDS-PAGE fueron electrotransferidos a nitrocelulosa y la señal fue revelada con quimioluminiscencia. De esta manera, se identificó la concentración con la que se obtuvo una señal óptima, que fue de 80 µg/100 µl, utilizando una dilución de antisuero primario de 1:250 y una dilución 1:5,000 del antisuero secundario. Cabe destacar, que la dilución óptima del antisuero primario se determinó utilizando la mínima concentración de antígeno capaz de generar resultados repetibles y ensayando las diluciones 1:150, 1:200 y 1:250. De la misma forma, en el caso del anticuerpo secundario el rango en el que se ha utilizado va desde 1:100 hasta 1:500,000, por lo que en este trabajo se ensayaron las diluciones 26

4 1:4,000 y 1:5,000, siendo la óptima la de 1:5,000, debido a que produjo menos reacciones inespecíficas con muestras de suero PPD negativas (www.cultek.com/inf/otros/soluciones/cultek-tecnicawb.pdf). Estas condiciones de electrotransferencia e inmunodetección para la detección de antígenos del filtrado de cultivo de Mycobacterium tuberculosis H37Rv, generaron los mismos resultados al ensayarlas con el suero del paciente sin tuberculosis con reacción positiva al PPD y el suero de una persona con tuberculosis activa. Por lo tanto, las condiciones del ensayo óptimas para el Western blot son: cantidad del antígeno aplicada al SDS-PAGE por pozo: 80 µg; electrotransferencia a 100 volts, por dos horas; inmunodetección, mediante incubación a 4 C, durante 12 horas, sin agitación, con el antisuero primario en dilución 1:250, seguido de la incubación con antisuero secundario en dilución 1:5,000, durante 2 horas a temperatura ambiente, sin agitación. Los resultados del ensayo Western blot se muestran en la figura 6, en la que se pueden observar las bandas de los antígenos inmunodetectados. Entre las bandas inmunodominantes identificadas se identificaron las de 38, 32 y 81 KDa, que podrían corresponder a las proteínas de 38 kda (Samanich y col., 2001), al complejo ag85 30/32 kda (Landowski y col., 2001), y a la proteína de 81 kda (Achkar y col., 2006). 27

5 1 2 Marcador PM Figura 6. Inmunodetección de antígenos de filtrado de cultivo de Mycobacterium tuberculosis H37Rv del medio Middlebrook 7H9, por el método de Western blot. La tira 1 fue ensayada con el suero de una persona sin tuberculosis con reacción positiva al PPD, la tira 2 con el suero de una persona con tuberculosis activa. Haciendo uso de un marcador de masas moleculares se estimaron las masas a las bandas que fueron inmunodetectadas. 28

6 Estandarización del Ensayo de Manchas (Dot blot) Para estandarizar el Dot blot, se inmovilizaron 0.06 y 0.03 µg del antígeno proteico (proteína de filtrado de cultivo de Mycobacterium tuberculosis H37Rv) en tiras independientes de nitrocelulosa, con la finalidad de ensayar dos tiras con diferente cantidad de antígeno con el suero de una persona sin tuberculosis con reacción positiva al PPD. De la misma forma, se cargaron dos tiras, utilizando 0.06 y 0.03 µg del antígeno, respectivamente, para ensayar el suero de una persona con tuberculosis activa. En la figura 7, se puede observar que no hubo diferencias en la señal obtenida al incubar las tiras con 0.03 µg ó 0.06 µg del antígeno, con el suero de la persona sin tuberculosis con reacción positiva al PPD. Sin embargo la señal de la tira con 0.06 µg de proteína fue mayor que la de la tira con 0.03 µg, cuando fueron incubadas con el suero de una persona sin tuberculosis con reacción positiva al PPD. Por lo anterior, se concluye que para realizar el ensayo Dot blot, deben inmovilizarse 0.06 µg del antígeno (contenidos en 1 µl de la solución proteica), incubar la tira de nitrocelulosa con el antisuero primario, en dilución1:50, durante 2 horas, a temperatura ambiente, con agitación moderada, y con el antisuero secundario en dilución 1:1,000, por 2 horas, a temperatura ambiente. Estas condiciones no son significativamente distintas a las utilizadas por otros investigadores, para estandarizar los ensayos Dot blot. Por ejemplo, en el estudio realizado por Vera-Cabrera y col., la concentración óptima del antígeno proteico 2,3 di-oacyltrehalosa (DAT) para distinguir un resultado positivo en pacientes con tuberculosis, con relación al de otro negativo en personas aparentemente sanas, fue de 1 µg, con el antisuero primario en dilución 1:80 y el antisuero secundario en dilución 1:500 (Vera-Cabrera y col., 1999). Otro estudio, que muestra la importancia de establecer condiciones óptimas para las técnicas inmunoquímicas, es el de Bemtley-Hibbert y col., en el cual se establecieron las 29

7 condiciones para determinar la concentración, del complejo antigénico 85 purificado de Mycobacterium bovis BCG, necesario para la detección de anticuerpos anti-ag85 presentes en el suero de pacientes con tuberculosis activa con PPD positivo y en pacientes con tuberculosis activa PPD negativo, y así comparar los niveles de expresión en los niveles de anticuerpo expresado en ambos grupos de pacientes (Bemtley-Hibbert y col.,1999). 30

8 Concentración proteica: µg 1 2 Figura 7. Inmunodetección de antígenos de filtrado de cultivo de Mycobacterium tuberculosis H37Rv del medio Middlebrook 7H9 por el método de Dot blot. La tira 1 fue ensayada con el suero de una persona con tuberculosis activa, la tira 2 fue ensayada con el suero de una persona sin tuberculosis con reacción positiva al PPD. 31

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