INMUNOLOGÍA APOPTOSIS. La apoptosis es un mecanismo que permite al organismo mantener un balance entre la generación y pérdida de células.

Transcripción

1 INMUNOLOGÍA - APOPTOSIS Y MUERTE CELULAR - EVALUACIÓN DEL ESTADO INMUNOLÓGICO Dr. Agustín Sansosti Alergología Hospital Virgen de la Arrixaca Murcia, España APOPTOSIS La apoptosis es un mecanismo que permite al organismo mantener un balance entre la generación y pérdida de células. NECROSIS -Debida a injurias externas (toxinas, trauma, etc.) -La membrana celular pierde su integridad - Por tanto, el contenido celular y productos tóxicos son liberados en el medio y producen una reacción inflamatoria Diferencia entre apoptosis y necrosis APOPTOSIS - Primero se condensa el núcleo. - Luego la membrana celular forma invaginaciones. - El contenido celular es expulsado en pequeñas vesículas. - Las enzimas y productos tóxicos no entran en contacto en el medio por tanto no hay inflamación 1

2 Regulación de la apoptosis La apoptosis es un proceso regulado geneticamente que requiere energía y síntesis de proteinas. Los receptores de superficie celular son importantes mediadores de este proceso ; por ejemplo CD95 es un importante receptor de superficie capaz de iniciar la apoptosis en diferentes tipos celulares, con activación de nucleasas que fragmentan el ADN CD 95 Activación N U C L E A S A S fragmentación APOPTOSIS 2

3 CASPASAS Muchos de los agentes inductores de la apoptosis ( ej: calcio, oxidantes) lo que provocan es la liberación al citoplasma de Caspasas, procedentes de las mitocondrias. Las caspasas son proteasas que se unen a un receptor en el citosol y actúan a manera de cascada ( caspasa 9- caspasa 7- caspasa 3), lo que lleva a la fragmentación del ADN y apoptosis. 3

4 Destrucción de células apoptóticas Durante la apoptosis, la célula en cuestión expresa en su superficie la fosfatidilserina, un compuesto que es reconocido por las células fagocíticas y gracias al cual, la célula es destruida. 4

5 Evaluación del estado inmunológico Técnicas de precipitación Electroforesis Aglutinación y Fijación de Complemento Elisa Inmunofluorescencia Western blot Técnicas de precipitación Una muestra de antígeno se coloca en una cubeta y se le hace reaccionar con el correspondiente anticuerpo, formándose inmunocomplejos ; el cambio de turbidez del medio se registra mediante fotometria. La cubeta es irradiada con luz láser, que se esparce desde los inmunocomplejos y es detectada por un fotómetro ; usando esa señal se puede determinar la concentración del antígeno. 5

6 Técnicas de precipitación FOTÓMETRO LÁSER INMUNOCOMPLEJOS Inmunodifusión radial simple (método de Mancini) En este test, una placa de agar se cubre con un gel con el correpondiente anticuerpo. El antígeno en cuestión se coloca en discos sobre la placa ; y el anticuerpo difunde radialmente en el gel, se forman inmunocomplejos y precipitan. Se dice que la concentración del antígeno es proporcional al diámetro del anillo de precipitación. Dicha concentración se determina a partir de curvas obtenidas con concentraciones conocidas del antígeno. 6

7 Inmunoelectroforesis Utilizada cuando se sospecha gamapatías mono y policlonales. Las inmunoglobulinas policlonales se distribuyen uniformemente en la fracción de las gammaglobulinas. Las monoclonales forman un componente dentro de la fracción de las gammaglobulinas, llevando a un patrón distintivo de identificación. 7

8 Reacción de fijación del complemento Consiste en la unión y activación del complemento por los complejos antígeno-anticuerpo ; utilizado para la detección de anticuerpos en el suero. Se añade al suero problema Antígeno + Complemento ; si en el suero existe el anticuerpo en cuestión, se forma el inmunocomplejo y se consume el complemento. Si no existe, el complemento queda disponible. Como sistema indicador se utilizan glóbulos rojos de animal : - Si se forma el inmunocomplejo, se consume el complemento ; por lo que no hay hemolisis. - Si no se forma el inmunocomplejo, queda el complemento ; se produce lisis. 8

9 ELISA Se puede emplear tanto para detectar anticuerpos como antígenos en suero. En el primer caso, se coloca un recipiente recubierto por el antígeno. Luego se deposita en el recipiente el suero del paciente ; si posee los anticuerpos frente al antígeno, estos se combinan formando inmunocomplejos. Luego se utilizan anticuerpos anti-anticuerpos,a los que se asocia una enzima. Esta enzima reacciona con el medio dando lugar a un cambio en la coloración del mismo. La concentración de anticuerpos de la muestra se puede conocer comparando con una muestra donde se conoce la concentración de los mismos. ANTÍGENO ANTICUERPO ENZIMA 9

10 INMUNOFLUORESCENCIA En la inmunofluorescencia, el anticuerpo va ligado a un marcador fluorescente. Existen 2 formas DIRECTA INDIRECTA En la directa, se emplean directamente los anticuerpos marcados dirigidos contra el antígeno en cuestión (se emplea para detectar antígenos) En la indirecta, se emplean los anticuerpos marcados frente a otros anticuerpos que se han ligado previamente al antígeno ( se emplea para detectar anticuerpos). 10

11 Western blot En esta técnica, las proteínas son separadas por electroforesis según su peso en un gel de poliacrilamida. Una vez separadas, son transferidas a desde el gel a una membrana de nitrocelulosa, donde pueden reconocerse por anticuerpos específicos. F I N 11