Trabajo Práctico: Análisis de poblaciones celulares por citometría de flujo.

Transcripción

1 Trabajo Práctico: Análisis de poblaciones celulares por citometría de flujo.

2 Objetivo: OBJETIVO: Identificación y enumeración de la subpoblación de linfocitos T (CD3 + ), células NK (CD3 - CD16 + CD56 + ) y linfocitos B (CD19 + ) de una muestra de sangre periférica, utilizando un reactivo de inmunofluorescencia directa de tres colores y posterior análisis por citometría de flujo.

3 Citometría de Flujo: principios y aplicaciones La citometría de flujo se basa en el hecho que partículas simples son conducidas por una corriente líquida de manera que puedan ser alineadas y que, en un breve período de tiempo, una a una pasen a través de una celda o cámara en la cual son analizadas. En dicha celda las partículas son impactadas por una fuente luminosa, como consecuencia de dicha interacción se generan señales ópticas, bandas espectrales en el espectro visible los que pueden ser detectados, integrados y obtener datos correspondientes a sus características físicas (tamaño, granularidad) o bioquímicas.

4 Ventajas La CF permite analizar individualmente un gran número de partículas en tiempos brevísimos ( cél/seg) generando información entre parámetros diferentes de cada partícula. Usando análisis estadístico es posible separar electrónicamente diferentes poblaciones e identificarlas usando técnicas de análisis multivariado. Finalmente, la técnica de sorting permite separar físicamente las células para su posterior análisis.

5 Componentes básicos de un citómetro: Sistema de fluídica Sistema de iluminación Sistema de detección Sistema de análisis

6 Flujo laminar

7 Determinación de parámetros celulares: CF permite realizar la medición de una variedad de características celulares: Tamaño celular relativo Granularidad y complejidad celular interna Niveles de autofluorescencia Presencia o ausencia de una marca fluorescente exógena

8 Tamaño relativo y complejidad

9 Fluorocromos Los fluorocromos son sustancias que al ser estimulados por fotones con una determinada longitud de onda, comprendida entre distintos rangos de excitación, emiten fotones de mayor longitud de onda (emisión). Cada compuesto posee une espectro de excitación y otro de emisión.

10 Determinaciones fluorescentes

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12 Áreas de competencia: Clínica médica, hematología, inmunología, oncología Medicina reproductiva Biología celular Microbiología Veterinaria Industria farmacéutica

13 Principales usos: Inmunofenotipificación nos permite analizar: Linajes celulares Estado de activación celular Capacidad de Homing Ensayos de funcionalidad celular: Producción de citoquinas Eflujo de Ca++ Fosforilación de proteínas ROI Proliferación celular Fagocitosis Despolarización mitocondrial

14 Inmunofenotipificación El inmunofenotipo es la identificación y cuantificación de distintas poblaciones celulares en base a la expresión diferencial de marcadores de membrana

15 Ciclo celular Otras aplicaciones: Movilización de Calcio intracelular Proliferación celular

16 MATERIALES -Reactivo CD3-FITC/CD16+CD56-PE/CD19-PECy5 (Cytognos) -Citómetro de Flujo equipado con láser de 488 nm y software asociado. -Tubos eppendorf. -Sangre obtenida por punción venosa, anticoagulada con EDTA. -Buffer de lisis de glóbulos rojos -Buffer salino (PBS)

17 Especificidad: El antígeno CD3 se encuentra en la superficie celular de timocitos maduros y linfocitos T en sangre periférica. CD3 es un miembro de la superfamilia de las inmunoglobulinas, que actúa como un mediador de la transducción de la señal, a través de la asociación con el receptor de los linfocitos T (TCR). CD3 es una proteína multimérica compuesta de cuatro cadenas polipeptídicas distintas (ε, γ, δ ζ,), que consta de dos heterodímeros (εγ, εδ) y un homodímero (ζζ). CD3 se expresa por un alto porcentaje de células T periféricas circulantes y se considera un marcador de linfocitos T. Los anticuerpos anti-cd3 se utilizan para la identificación y cuantificación del % de linfocitos T en muestras de sangre o preparaciones celulares. Se utilizan frecuentemente para la clasificación clínica de muestras hematológicas en pacientes con leucemias, linfomas o inmunodeficiencias.

18 El antígeno CD19 se encuentra en la superficie celular de los linfocitos B normales y neoplásicos, está ausente en las LT, monocitos y granulocitos. CD19 es un miembro de la superfamilia de las inmunoglobulinas, que actúa como una molécula de transducción de señales crítica y reguladora del desarrollo, diferenciación y activación de linfocitos B. CD19 se expresa en las células dendríticas foliculares y linfocitos B, desde los primeros estadíos reconocibles de linaje B, su expresión se pierde en la maduración a plasmocitos. CD19 es un marcador linfocitos B comúnmente utilizado. El antígeno CD56 se encuentra en las células NK y en subpoblaciones de LT CD3+CD4+ y CD3+CD8+. Los LB normales, monocitos y granulocitos no expresan el antígeno CD56 en su superficie. La combinación CD16 / CD56 facilita la identificación de células NK, como subpoblaciones que expresan CD16 + / CD56 +, CD16 + / CD56- o CD16 / CD56 +, pero carecen de CD3 y receptor de células T (TCR).

19 PROCEDIMIENTO 1- Mezclar 100μl de sangre periférica con 26μl del reactivo: CD3-FITC/CD16+CD56- PE/CD19-PECy5. 2- Para evaluar la unión inespecífica del anticuerpo puede prepararse un tubo control de isotipo. 3- Incubar 20 minutos a temperatura ambiente en oscuridad. 4- Añadir 1 ml de buffer de lisis de glóbulos rojos e incubar la muestra durante 10 minutos a temperatura ambiente en oscuridad. 5- Lavado: pasar la muestra a un tubo falcon de 15 ml conteniendo 10 ml de PBS frío. Centrifugar a 400xg durante 5 min. 6- Descartar el sobrenadante por volcado y resuspender el pellet de células en 1 ml de PBS. Mantener en hielo y al resgurado de la luz. 7- Analizar por citometría de flujo.

20 Análisis: Antes de adquirir las muestras, ajustar las condiciones de adquisición para minimizar el debris y asegurarse de que la población celular de interés se distingue apropiadamente. Verificar que el citómetro está alineado correctamente y estandarizado para dispersión de la luz (FSC/SSC en escala lineal) e intensidad de fluorescencia (FL1, FL2 y FL3 en escala logarítmica).

21 Crear regiones: R2: linfocitos: pequeños y de granularidad baja R1: monocitos R3: granulocitos Stats: Region X-Mean Y-Mean Events %Total %Gated R R R R

22 En R2: linfocitos

23 controles de isotipo con marca 0,07% 0,00% 13,1% 0,28% FL3 99,9% 0,03% 30,8% 55,8% FL1 0,00% 0,03% 22,8% 5,32% FL2 99,9% 0,00% 21,1% 50,7% FL1

24 Los resultados se deberán informar como porcentaje de linfocitos T, células NK y linfocitos B respecto al total de linfocitos o leucocitos presentes en la muestra que a su vez puede determinarse por CF en base a su característico patrón de FSC/SSC (tamaño/granularidad o complejidad interna). Valores de referencia (adultos) Linfocitos T: 61-85% Células NK: 6-29% Linfocitos B: 7-23% (% obtenido por CF respecto del total de linfocitos presente en la muestra)