Fundamentos y aplicaciones analíticas y separativas de la inmunofluorescencia y la citometría de flujo

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1 Fundamentos y aplicaciones analíticas y separativas de la inmunofluorescencia y la citometría de flujo Asignatura de Inmunología Universidad de Alcalá Unidad mixta CSIC/UAH Objetivos Entender la citometría de flujo como herramienta de estudio de la heterogeneidad celular en el campo del sistema inmune Conocer los fundamentos de la citometría de flujo Conocer la aplicaciones tanto clínicas como en investigación que se realizan mediante la citometría de flujo 4 Puesta a punto, familiarización y conceptos prácticos de un citometro de flujo 5 Obtención de células mononucleares procedentes de sangre periférica 6 Realización de un staining directo(marcaje) de estas células mononucleares mediante el uso de anticuerpos monoclonales específicos

2 Objetivos 7 Adquisición en un citometro de flujo 8 Estudio de la viabilidad mediante el uso de sondas intercalantes del ADN 9 Análisis de diferentes tipos de imágenes de citometría de flujo: Comprender las etapas en el proceso de la información obtenida por citometría 0 Resolución de diferentes problemas clínicos reales Estudio de los porcentajes, calculo de cifras absolutas e interpretación de intensidades medias de florescencia de células linfocitarias obtenidas de distintos casos patológicos reales Interpretación de los resultados obtenidos Qué debe ser el alumno al terminar el curso? Que después del curso el alumno sea: Conocedor de los fundamentos y consciente de las aplicaciones de la citometría de flujo Eficiente preparando muestras para citometría y diseñando experimentos de citometría analítica y separativa Usuario competente y autosuficiente del citómetro de flujo analizador capaz de puesta a punto, adquisición y capaz de diagnosticar y solucionar situaciones problemáticas (compensación, flujo) 4 Analizador crítico conocedor de las posibilidades de los software de análisis y exportación de datos

3 Prácticas de Inmunología Primer día: Seminarios Interactivos ( horas): Fundamentos en Inmunofluorescencia y Citometría de flujo Aplicaciones de la citometría de flujo Segundo y tercer día: Dos actividades simultáneas (5 horas): - Realización de una separación célular de células mononucleares de sangre periférica - Contaje de las células Citómetro de flujo: Fundamentos y utilización de un citómetro de flujo (5 horas) Marcaje de superficie e intracelular de linfocitos de sangre periférica (5 horas): a Marcaje de superficie b Viabilidad (7add) c Anexina V Cuarto día ( horas): Análisis de imágenes de citometría de flujo Problemas Relevancia Estudio directo de las patologías mediante esta tecnología: Conocimiento y búsqueda de información de carácter pronóstico Interpretación de vuestra fuente de lectura: la bibliografía de toda la comunidad científica biomédica

4 Evolución de la citometría multiparamétrica 5 0 NºColores 7 F 4 D 4 0 NºColores 6- F Nº de Colores F Nace - F F 8 F F Nº de Colores F F 4 F s 980s s Evolución Temporal EEUU Evolución Temporal Nuestro Laboratorio NºArtículos Nº Artículos trabajando en Citometría de Flujo NºArticulos s 980s Evolución temporal!!!más colores, más información!!!!!!análisis cada vez más complicados!!!!! Demanda: - Nuevas herramientas - Nuevas Estrategias de análisis Heterogeneidad celular en el sistema inmune T4 T8 NK B Mono Neu CD45 CD CD9 CD4 CD5 CD CD56 CD4 CD8 CD45RA CD45RO CD45RA CD45RO CD45RA

5 Criterios de caracterización de los tipos celulares Celulares Morfología al microscopio Moleculares Genotípico (Genoma) Recombinaciones somáticas Fenotípico (Proteoma) RNA expresado, proteínas Citoma: Análisis estadístico multi-celular - Antígenos de diferenciación linfocitaria Los antígenos de superficie pueden ser utilizados como marcadores específicos de líneas, tipos y subtipos celulares Para estudiar la heterogeneidad celular son necesarias técnicas: Con resolución a nivel de célula individual Que caractericen la célula en función de varias características (parámetros) X, Y, Z Capaces de realizar medidas en números representativos de células 00 células error ± 0%, 0000 error ± % 4 Capaces de almacenar, procesar, representar, analizar y reducir toda esa información sobre células individuales en conclusiones útiles acerca de las poblaciones celulares

6 Morfología y antígenos de diferenciación en el análisis de la heterogeneidad celular Granulocitos CD5+ Monocitos CD4+ FSC-Height -> C54400 Linfocitos CD+ Ταβ Τγδ CD4+ CD8+ CD56+ CD9+ CD5+ CD5- Fases de la citometría: Pre-citometría: Anticuerpos monoclonales y sondas: Estudio a nivel tisular Estudio a nivel celular Técnicas de separación celular Técnicas en Inmunofluorescencia Citómetria (Alternativas: Microscopia de fluorescencia, Confocal, Genética Molecular ) Análisis cuantitativo 4 Análisis biológico

7 Anticuerpos como herramientas en investigación Ventaja Capacidad de reconocimiento muy específica Detección muy sensible picomolar Inconveniente Son invisibles Conjugación con moléculas reporter Radioisótopos: RIA, Rosalyn Yalow 977 Enzimas: ELISA, inmunohistoquímica Moléculas fluorescentes: inmunofluorescencia, citometría de flujo, LSC Técnicas de separación celular - Células en tejidos: - Células en disolución: Gradientes de densidad: Medios de densidad constante Gradientes continuos o discontinuos Elutriación centrifuga Sorting: - Magnético - Sorter Inmunohistoquímica Procesamiento mécanico Separación por mallas y filtros

8 Técnica de separación mediante Ficoll-Hypaque Tipos de marcajes inmunofluorescentes Directo Indirecto Biotinado b b b b b b b b b b b b

9 Microscopia de fluorescencia FUNDAMENTOS DE LA CITOMETRÍA DE FLUJO

10 Qué es la citometría de flujo? Amplificación digitalización Representación y Analisis Láser 90º Detectores de luz Meeting point Columna de muestra Flujo - 4º FSC VENTAJAS DE LA CITOMETRÍA DE FLUJO - Medidas multiparamétricas (x, y, z) en grandes números de células individuales (miles) - Aumento en la representatividad de las muestras estudiadas y en la precisión de las medidas - A menor tiempo de dedicación mayor productividad DESVENTAJAS La citometría de flujo no aporta información sobre la distribución espacial de las células estudiadas

11

12 Citómetro de flujo

13 Cómo funciona un citómetro? Sistema de flujo Dispersión de la luz Fluorescencia Separación y detección de la luz Amplificación Corrección de errores: solapamiento espectral y formación de dobletes Digitalización y almacenamiento de la información SISTEMA DE ABSORCION DE MUESTRA AIRE MUESTRA FLUJO MUESTRA

14 Luz incidente Luz dispersada lateralmente y luz fluorescente, α = 90º 90º Luz dispersada hacia delante, α=- 4º Cámara de flujo FSC Columna de muestra Fluido envolvente INFORMACIÓN QUE SE OBTIENE: LUZ - PROPIEDADES AL ATRAVESAR LA LUZ: - LUZ REFLEJADA O DIFRACTADA - PROPIEDADES FLUORESCENTES: -FLUOROCROMOS (FITC, PE, APC, TC )

15 Luz dispersada a 90 grados Laser Detector Detector de 90º DETECCION DE LUZ DISPERSADA HACIA DELANTE (FORWARD SCATTERED LIGHT, FSC) SSC FSC El detector de FSC convierte luz dispersada hacia delante en un pulso de voltaje proporcional al tamaño de la célula/particula

16 DETECCION DE LUZ DISPERSADA LATERALMENTE (SIDE SCATTERED LIGHT, SSC) SSC FSC El detector de SSC convierte la luz dispersada lateralmente en un pulso de voltaje proporcional a l contenido en orgánulos membranosos (granularidad) Morfología y antígenos de diferenciación en el análisis de la heterogeneidad celular Granulocitos CD5+ Monocitos CD4+ FSC-Height -> C54400 Linfocitos CD+ Ταβ Τγδ CD4+ CD8+ CD56+ CD9+ CD5+ CD5-

17 Detectores de fluorescencia Laser Detector Freq Fluorescencia Detector de fluorescencia (PMT, PMT4 etc) Fluorescencia FL- FL- FSC

18 Imagen de Fluorescencia: Doble Marcaje CD6 PE y CD Percp Fluorescencia Proceso por el que una molécula absorbe luz, aumenta su energía y vuelve al estado basal emitiendo un fotón Parte de la energía se pierde en las transiciones entre los distintos estados por tanto el fotón emitido tiene menos energía (mayor longitud de onda) que el que fue absorbido E λ λ λ <λ t (μs)

19 R e la t iv e I n t e n s it y Wavelength 400 nm 500 nm 600 nm 700 nm Espectro de Absorción Espectros Representación de la intensidad de absorción de luz de distintas las longitudes de onda por una sustancia Espectro de Emisión Representación de la intensidad de emisión de una sustancia excitada con luz de una determinada longitud de onda Intensidad de fluorescencia excitación λ (nm) medida Fluoresceina (FITC) Excitación Emisión 00 nm 400 nm 500 nm 600 nm 700 nm Proteinas

20 Laseres comunes nm 400 nm 500 nm 600 nm 700 nm PE-TR Conj Texas Red PI Etidio PE FITC Acido Parinárico Fluorocromos

21 Sondas Proceso de señales Separación de señales luminosas Detección de señales luminosas Amplificación de señales eléctricas 4 Corrección de errores Compensación de señales Discriminación de señales debidas a dobletes (proceso de pulsos) 6 Transformación de señales eléctricas analógicas en digitales 7 Almacenamiento matricial (list mode) de la información resultante

22 Optica en los citómetros de flujo PMT 4 Flujo Celular Filtros Dicroicos PMT PMT Bandpass Filtros Laser PMT DETECCIÓN DE FLUORESCENCIA Fluorocromos TC PerCP QR Cy5 APC Detectores FL- FL- FL- FL-4

23 Amplificación de señales Lineal (intervalos regulares) apropiada para: Señales que oscilan en un rango limitado (0-000) Con distribuciones con picos estrechos como el contenido en DNA Logarítmica (intervalos crecientes) Cubre un rango más amplio de variación de la señal (0-0000) Escalas FSC Ej: Lineal FL- Ej: Logarítmica

24 Compensación de señales Fundamento Superposición de espectros de emisión Parte de la señal de emitida por un fluorocromo es leída por el detector de otro color Concepto sustracción de una parte de la señal medida en un color a la señal medida en otro color FL- - %FL Intensidad de fluorescencia excitación medida FL- FL- λ Discriminación de señales debidas a dobletes (proceso de pulsos) Señal analógica (V) Altura de señal (H) Anchura de señal (W) Área de señal (A) En base a la información de área y anchura se pueden detectar dobletes (dos células que pasan juntas) V A W t H xw

25 DIGITALIZACION Y ALMACENAMIENTO DE INFORMACIÓN N FSC 4 4 SSC 8 FL- 4 FL- FL- 4 4 FL TIEMPO Los pulsos de Voltaje (señales analógicas) son transformadas en señales digitales Las señales digitales almacenan en un soporte informático en modo listado (almacenamiento multiparamétrico) PROCESO DE INFORMACION Histogramas Diagramas biparamétricos

26 Proceso de la información generada Representación de la información Selección de la información Reducción de la información De la célula a la población celular Representación monoparamétrica de datos Histogramas Se representa en cada valor de x (intensidad de fluorescencia) el número de células que emiten esa intensidad M

27 Histogramas FL- SSC FL- FSC FL- Representación biparamétrica en D Diagrama de puntos / dot plot Representación simultánea de dos parámetros X e Y X representa el valor de la señal de un parámetro FL Y representa el valor de la señal del otro - - FL- + -

28 Representación D Countour plot / Diagramas de contornos X, Y más una tercera dimensión Una superficie tridimensional La altura representa el número de células con una determinada combinación de ambos parámetros Diagrama de dot plot density

29 Selección de la información Gates (Puertas) / ventanas (windows) Selección de subpoblaciones definidas en diagramas monoparamétricos Sitúan los valores límite superior e inferior de un parámetro que definen a las células de interés M M Gates biparamétricos Se pueden utilizar puertas biparamétricas definidas en base a la combinación de los valores de dos parámetros Se emplean para estudiar las características de subpoblaciones celulares R4 R R R

30 Gates lógicos / Puertas lógicas Pueden combinarse distintas puertas y emplearse simultáneamente como criterio para seleccionar las células de interés COMPLEJIDAD CELULAR LINFOCITOS R5 GRANULOCITOS R7 MONOCITOS R6 R4 R R R NK TK T TAMAÑO R5 and R Qué significa la realización de un gate electrónico? N FSC SSC FL- FL- FL- FL-4 TIEMPO Jorge 0000 Monserrat Sanz

31 Análisis de la información Estadisticas monoparamétricas M M Histogram Statistics File: ap-4h0 Log Data Units: Linear Values Tube: Panel: Acquisition Date: 6-Apr-99 Gate: G Gated Events: 997 Total Events: 0000 X Parameter: FL-H FL-IP (Log) Marker Left, Right Events % Gated % Total Mean Geo Mean CV Median Peak All, M 685, M 4, Estadisticas biparamétricas Cuadrantes Combinación de dos umbrales de positividad para dos parámetros Número de células Quadrant Statistics % de células MFI mean, geo mean File: FEN-AR007 Log Data Units: Linear Values Sample ID: Patient ID: Tube: tube #7 Panel: Bronquiris Acquisition Date: 5-Jun-98 Gate: No Gate Gated Events: 5000 Total Events: 5000 X Parameter: FL-H CD FITC (Log) Y Parameter: FL-H CD6 PE (Log) Quad Location: 5, 7 Quad Events % Gated % Total X Mean X Geo Mean Y Mean Y Geo Mean UL UR LL LR

32 Estadística por regiones Selección libre de un conjunto de combinaciones de valores correspondientes a dos parámetros R Microbeads R Linfocitos Información generada de una muestra marcada en triple color Quadrant Statistics File: FEN-AR007 Log Data Units: Linear Values Sample ID: Patient ID: Tube: tube #7 Panel: Bronquiris Acquisition Date: 5-Jun-98 Gate: No Gate Total Events: 5000 Gated Events: 5000 X Parameter: FL-H CD FITC (Log) Y Parameter: FL-H CD6 PE (Log) Quad Location: 5, 7 Quad Events % Gated % Total X Mean X Geo Mean Y Mean Y Geo Mean UL UR LL LR Quadrant Statistics File: FEN-AR007 Log Data Units: Linear Values Sample ID: Patient ID: Tube: tube #7 Panel: Bronquiris Acquisition Date: 5-Jun-98 Gate: No Gate Total Events: 5000 Gated Events: 5000 X Parameter: FL-H CD FITC (Log) Y Parameter: FL-H CD6 PE (Log) Quad Location: 5, 7 Quad Events % Gated % Total X Mean X Geo Mean Y Mean Y Geo Mean UL UR LL LR Quadrant Statistics File: FEN-AR007 Log Data Units: Linear Values Sample ID: Patient ID: Tube: tube #7 Panel: Bronquiris Acquisition Date: 5-Jun-98 Gate: No Gate Total Events: 5000 Gated Events: 5000 X Parameter: FL-H CD FITC (Log) Y Parameter: FL-H CD6 PE (Log) Quad Location: 5, 7 Quad Events % Gated % Total X Mean X Geo Mean Y Mean Y Geo Mean UL UR LL LR Jorge Del Monserrat análisis de Sanz cada matriz (9x0000) nos quedamos con -4 nímeros

33 Estadísticas/Reducción de la información Análisis gráfico ofrece información numérica sobre las poblaciones estudiadas Esta información numérica de una muestra se representará en una fila de una matriz de datos Con la matriz de datos se obtendrá información estadística y representaciones gráficas sobre poblaciones de individuos células parámetros caso 9x 0000 variables Población casos Población control