Fundamentos y aplicaciones analíticas y separativas de la inmunofluorescencia y la citometría de flujo

Transcripción

1 Fundamentos y aplicaciones analíticas y separativas de la inmunofluorescencia y la citometría de flujo Asignatura de Inmunología Universidad de Alcalá Unidad mixta CSIC/UAH

2 Objetivos Entender la citometría de flujo como herramienta de estudio de la heterogeneidad celular en el campo del sistema inmune Conocer los fundamentos de la citometría de flujo 3 Conocer la aplicaciones tanto clínicas como en investigación que se realizan mediante la citometría de flujo 4 Puesta a punto, familiarización y conceptos prácticos de un citometro de flujo 5 Obtención de células mononucleares procedentes de sangre periférica 6 Realización de un staining directo(marcaje) de estas células mononucleares mediante el uso de anticuerpos monoclonales específicos

3 Objetivos 7 Adquisición en un citometro de flujo 8 Estudio de la viabilidad mediante el uso de sondas intercalantes del ADN 9 Análisis de diferentes tipos de imágenes de citometría de flujo: Comprender las etapas en el proceso de la información n obtenida por citometría 0 Resolución de diferentes problemas clínicos reales Estudio de los porcentajes, calculo de cifras absolutas e interpretación de intensidades medias de florescencia de células linfocitarias obtenidas de distintos casos patológicos reales Interpretación de los resultados obtenidos

4 Qué debe ser el alumno al terminar el curso? Que después del curso el alumno sea: Conocedor de los fundamentos y consciente de las aplicaciones de la citometría de flujo Eficiente preparando muestras para citometría y diseñando experimentos de citometría analítica y separativa 3 Usuario competente y autosuficiente del citómetro de flujo analizador capaz de puesta a punto, adquisición y capaz de diagnosticar y solucionar situaciones problemáticas (compensación, flujo) 4 Analizador crítico conocedor de las posibilidades de los software de análisis y exportación de datos

5 Prácticas de Inmunología Clínica Primer día: Seminarios Interactivos: Fundamentos en Inmunofluorescencia y Citometría de flujo Aplicaciones de la citometría de flujo 3 Citómica: Aplicaciones clínicas Segundo y tercer día: Dos actividades simultáneas ( horas): - Realización de una separación célular de células mononucleares de sangre periférica - Contaje de las células Citómetro de flujo: Fundamentos y utilización de un citómetro de flujo ( horas) 3 Marcaje de superficie e intracelular de linfocitos de sangre periférica ( horas): a Marcaje de superficie b Viabilidad (7add) c Anexina V Cuarto día (4 horas): Análisis de imágenes de citometría de flujo Problemas

6 Relevancia Estudio directo de las patologías mediante esta tecnología: Conocimiento y búsqueda de información de carácter pronóstico Interpretación de vuestra fuente de lectura: la bibliografía de toda la comunidad científica biomédica

7 Heterogeneidad celular en el sistema inmune T4 T8 NK B Mono Neu CD45 CD CD9 CD4 CD5 CD3 CD56 CD4 CD8 CD45RA CD45RO CD45RA CD45RO CD45RA

8 Criterios de caracterización n de los tipos celulares Celulares Morfología a al microscopio Moleculares Genotípico pico (Genoma) Recombinaciones somáticas Fenotípico (Proteoma( Proteoma) RNA expresado, proteínas Citoma: : Análisis estadístico stico multi-celular - Antígenos de diferenciación n linfocitaria Los antígenos de superficie pueden ser utilizados como marcadores específicos de líneas, l tipos y subtipos celulares

9 Para estudiar la heterogeneidad celular son necesarias técnicas: t Con resolución n a nivel de célula c individual Que caractericen la célula c en función n de varias características (parámetros) X, Y, Z 3 Capaces de realizar medidas en números n representativos de células c 00 células c error ± 0%, 0000 error ± % 4 Capaces de almacenar, procesar, representar, analizar y reducir toda esa información n sobre células c individuales en conclusiones útiles acerca de las poblaciones celulares

10 Morfología a y antígenos de diferenciación n en el análisis de la heterogeneidad celular Granulocitos CD5+ Monocitos CD4+ FSC-Height -> C54400 Linfocitos CD3+ Ταβ Τγδ CD4+ CD8+ CD56+ CD9+ CD5+ CD5-

11 Fases de la citometría: Pre-citometría: Anticuerpos monoclonales y sondas: Estudio a nivel tisular Estudio a nivel celular Técnicas de separación celular 3 Técnicas en Inmunofluorescencia Citómetria (Alternativas: Microscopia de fluorescencia, Confocal, Genética Molecular ) 3 Análisis cuantitativo 4 Análisis biológico

12 Anticuerpos como herramientas en investigación Ventaja Capacidad de reconocimiento muy específica Detección muy sensible picomolar Inconveniente Son invisibles Conjugación con moléculas reporter Radioisótopos: RIA, Rosalyn Yalow 977 Enzimas: ELISA, inmunohistoquímica Moléculas fluorescentes: inmunofluorescencia, citometría de flujo, LSC

13 Técnicas de separación celular - Células en tejidos: Inmunohistoquímica Procesamiento mécanico 3 Separación por mallas y filtros - Células en disolución: Gradientes de densidad: Medios de densidad constante Gradientes continuos o discontinuos Elutriación centrifuga Sorting: - Magnético -Sorter

14 Técnica de separación mediante Ficoll-Hypaque

15 Tipos de marcajes inmunofluorescentes Directo Indirecto Biotinado b b b b b b b b b b b b

16 Microscopia de fluorescencia

17 FUNDAMENTOS DE LA CITOMETRÍA DE FLUJO

18 Qué es la citometría de flujo? Amplificación digitalización Representación y Analisis Láser Meeting point 90º Detectores de luz Columna de muestra Flujo - 4º FSC

19 VENTAJAS DE LA CITOMETRÍA DE FLUJO - Medidas multiparamétricas (x, y, z) en grandes números de células individuales (miles) - Aumento en la representatividad de las muestras estudiadas y en la precisión de las medidas - A menor tiempo de dedicación mayor productividad DESVENTAJAS La citometría de flujo no aporta información sobre la distribución espacial de las células estudiadas

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23 Citómetro de flujo

24 Cómo funciona un citómetro? Sistema de flujo Dispersión de la luz Fluorescencia Separación y detección de la luz Amplificación Corrección de errores: solapamiento espectral y formación de dobletes Digitalización y almacenamiento de la información

25 SISTEMA DE ABSORCION DE MUESTRA AIRE MUESTRA FLUJO MUESTRA

26 Luz incidente 90º Luz dispersada hacia delante, α=- 4º FSC Luz dispersada lateralmente y luz fluorescente, α = 90º Cámara de flujo Columna de muestra Fluido envolvente

27 INFORMACIÓN QUE SE OBTIENE: LUZ - PROPIEDADES AL ATRAVESAR LA LUZ: - LUZ REFLEJADA O DIFRACTADA - PROPIEDADES FLUORESCENTES: - FLUOROCROMOS (FITC, PE, APC, TC )

28 Luz dispersada a 90 grados Laser Detector Detector de 90º

29 DETECCION DE LUZ DISPERSADA HACIA DELANTE (FORWARD SCATTERED LIGHT, FSC) SSC FSC El detector de FSC convierte luz dispersada hacia delante en un pulso de voltaje proporcional al tamaño de la célula/particula

30 DETECCION DE LUZ DISPERSADA LATERALMENTE (SIDE SCATTERED LIGHT, SSC) SSC FSC El detector de SSC convierte la luz dispersada lateralmente en un pulso de voltaje proporcional a l contenido en orgánulos membranosos (granularidad)

31 Morfología a y antígenos de diferenciación n en el análisis de la heterogeneidad celular Granulocitos CD5+ Monocitos CD4+ FSC-Height -> C54400 Linfocitos CD3+ Ταβ Τγδ CD4+ CD8+ CD56+ CD9+ CD5+ CD5-

32 Detectores de fluorescencia Laser Detector Freq Detector de fluorescencia (PMT3, PMT4 etc) Fluorescencia

33 Fluorescencia FL- FL- FSC

34 Imagen de Fluorescencia: Doble Marcaje CD6 PE y CD3 Percp

35 Fluorescencia Proceso por el que una molécula absorbe luz, aumenta su energía y vuelve al estado basal emitiendo un fotón Parte de la energía se pierde en las transiciones entre los distintos estados por tanto el fotón emitido tiene menos energía (mayor longitud de onda) que el que fue absorbido E λ λ λ <λ t (μs)(

36 Espectro de Absorción Espectros Representación de la intensidad de absorción de luz de distintas las longitudes de onda por una sustancia Espectro de Emisión Representación de la intensidad de emisión de una sustancia excitada con luz de una determinada longitud de onda Intensidad de fluorescencia excitación λ (nm) medida

37 Relative Intensity Wavelength 400 nm 500 nm 600 nm 700 nm Fluoresceina (FITC) Excitación Emisión 300 nm 400 nm 500 nm 600 nm 700 nm Proteinas

38 Laseres comunes nm 400 nm 500 nm 600 nm 700 nm PE-TR Conj Texas Red PI Etidio PE FITC Acido Parinárico

39 Fluorocromos

40 Sondas

41 Proceso de señales Separación de señales luminosas Detección de señales luminosas 3 Amplificación de señales eléctricas 4 Corrección de errores Compensación de señales Discriminación de señales debidas a dobletes (proceso de pulsos) 6 Transformación n de señales eléctricas analógicas en digitales 7 Almacenamiento matricial (list( mode) ) de la información resultante

42 Optica en los citómetros de flujo PMT 4 Flujo Celular Filtros Dicroicos PMT PMT Bandpass Filtros Laser PMT 3

43 DETECCIÓN DE FLUORESCENCIA Fluorocromos TC PerCP QR Cy5 APC Detectores FL- FL- FL-3 FL-4

44 Amplificación de señales Lineal (intervalos regulares) apropiada para: Señales que oscilan en un rango limitado (0-000) Con distribuciones con picos estrechos como el contenido en DNA Logarítmica (intervalos crecientes) Cubre un rango más amplio de variación de la señal (0-0000)

45 Escalas FSC Ej: : Lineal FL- Ej: : Logarítmica

46 Compensación de señales Fundamento Superposición de espectros de emisión Parte de la señal de emitida por un fluorocromo es leída por el detector de otro color Concepto sustracción de una parte de la señal medida en un color a la señal medida en otro color FL- -%FL Intensidad de fluorescencia excitación medida FL- FL- λ

47 Discriminación de señales debidas a dobletes (proceso de pulsos) Señal analógica (V) Altura de señal (H) Anchura de señal (W) Área de señal (A) V A H En base a la información de área y anchura se pueden detectar dobletes (dos células que pasan juntas) W t xw

48 DIGITALIZACION Y ALMACENAMIENTO DE INFORMACIÓN N FSC SSC Los pulsos de Voltaje Voltaje (señales analógicas gicas) ) son transformadas en señales digitales Las señales digitales almacenan en un soporte informático en modo listado (almacenamiento multiparamétrico trico) 3 8 FL- 3 4 FL- 3 3 FL FL TIEMPO

49 PROCESO DE INFORMACION Histogramas Diagramas Diagramas biparamétricos

50 Proceso de la información generada Representación de la información Selección de la información Reducción de la información De la célula a la población celular

51 Representación monoparamétrica de datos Histogramas Se representa en cada valor de x (intensidad de fluorescencia) el número n de células que emiten esa intensidad M

52 Histogramas FL- SSC FL- FSC FL-3

53 Representación biparamétrica en D Diagrama de puntos / dot plot Representación n simultánea de dos parámetros X e Y X representa el valor de la señal de un parámetro metro FL Y representa el valor de la señal del otro - - FL- + -

54 Representación n 3D Countour plot / Diagramas de contornos X, Y más m s una tercera dimensión n Una superficie tridimensional La altura representa el número n de células con una determinada combinación n de ambos parámetros

55 Diagrama de dot plot density

56 Selección n de la información Gates (Puertas) / ventanas (windows( windows) Selección n de subpoblaciones definidas en diagramas monoparamétricos Sitúan los valores límite l superior e inferior de un parámetro que definen a las células c de interés M M

57 Gates biparamétricos tricos Se pueden utilizar puertas biparamétricas definidas en base a la combinación n de los valores de dos parámetros Se emplean para estudiar las características de subpoblaciones celulares R4 R R3 R

58 Gates lógicos / Puertas lógicasl Pueden combinarse distintas puertas y emplearse simultáneamente como criterio para seleccionar las células c de interés COMPLEJIDAD CELULAR LINFOCITOS R5 GRANULOCITOS R7 MONOCITOS R6 R4 R R3 R NK TK T TAMAÑO R5 and R

59 Qué significa la realización de un gate electrónico? Qué significa la realización de un gate electrónico? N FSC SSC 8 FL- 3 4 FL- 3 3 FL FL TIEMPO

60 Análisis de la información Estadisticas monoparamétricas M M Histogram Statistics File: ap-4h0 Log Data Units: Linear Values Tube: Panel: Acquisition Date: 6-Apr-99 Gate: G3 Gated Events: 997 Total Events: 0000 X Parameter: FL3-H FL3-IP (Log) Marker Left, Right Events % Gated % Total Mean Geo Mean CV Median Peak All, M 685, M 4,

61 Estadisticas biparamétricas Cuadrantes Combinación de dos umbrales de positividad para dos parámetros Número de células Quadrant Statistics % de células MFI mean, geo mean File: FEN-AR007 Log Data Units: Linear Values Sample ID: Patient ID: Tube: tube #7 Panel: Bronquiris Acquisition Date: 5-Jun-98 Gate: No Gate Gated Events: 5000 Total Events: 5000 X Parameter: FL-H CD FITC (Log) Y Parameter: FL-H CD6 PE (Log) Quad Location: 5, 7 Quad Events % Gated % Total X Mean X Geo Mean Y Mean Y Geo Mean UL UR LL LR

62 Estadística por regiones Selección libre de un conjunto de combinaciones de valores correspondientes a dos parámetros R Microbeads Linfocitos R

63 Información generada de una muestra marcada en triple color Quadrant Statistics File: FEN-AR007 Log Data Units: Linear Values Sample ID: Patient ID: Tube: tube #7 Panel: Bronquiris Acquisition Date: 5-Jun-98 Gate: No Gate Gated Events: 5000 Total Events: 5000 X Parameter: FL-H CD FITC (Log) Y Parameter: FL-H CD6 PE (Log) Quad Location: 5, 7 Quad Events % Gated % Total X Mean X Geo Mean Y Mean Y Geo Mean UL UR LL LR Quadrant Statistics File: FEN-AR007 Log Data Units: Linear Values Sample ID: Patient ID: Tube: tube #7 Panel: Bronquiris Acquisition Date: 5-Jun-98 Gate: No Gate Gated Events: 5000 Total Events: 5000 X Parameter: FL-H CD FITC (Log) Y Parameter: FL-H CD6 PE (Log) Quad Location: 5, 7 Quad Events % Gated % Total X Mean X Geo Mean Y Mean Y Geo Mean UL UR LL LR Quadrant Statistics File: FEN-AR007 Log Data Units: Linear Values Sample ID: Patient ID: Tube: tube #7 Panel: Bronquiris Acquisition Date: 5-Jun-98 Gate: No Gate Gated Events: 5000 Total Events: 5000 X Parameter: FL-H CD FITC (Log) Y Parameter: FL-H CD6 PE (Log) Quad Location: 5, 7 Quad Events % Gated % Total X Mean X Geo Mean Y Mean Y Geo Mean UL UR LL LR Jorge Del Monserrat análisis de Sanz cada matriz (9x0000) nos quedamos con -4 4 nímeros

64 Población casos Población control Estadísticas/Reducción de la información Análisis gráfico ofrece información numérica sobre las poblaciones estudiadas Esta información numérica de una muestra se representará en una fila de una matriz de datos Con la matriz de datos se obtendrá información estadística y representaciones gráficas sobre poblaciones de individuos células parámetros caso 9x 0000 variables