IV simposio Internacional de Regreso a la U.

Transcripción

1 IV simposio Internacional de Regreso a la U. Perspectivas diagnósticas y pronosticas del laboratorio en la práctica clínica Tallerpruebas diagnósticas en Inmunodeficiencias primarias Dra. María Claudia Ortega Dr. Carlos E Olmos O. Dr. Jairo Muñoz. Ma. Consuelo Romero S

2 Citometría de flujo al alcance de las inmunodeficiencias primarias-idp Ma.Consuelo Romero S, PhD-Jairo Muñoz, MSc Zulma Maldonado, Bcl-Clara M. Manosalva Bcl Unidad de IDP-Instituto de Referencia Andino

3 Taller pruebas diagnósticas en Inmunodeficiencias primarias Inmunodefiencias Citometría de Flujo

4 Inmunodeficiencias Grupo heterogéneo de patologías que como resultado de anormalidades en el sistema inmune producen un incremento en la susceptibilidad a infecciones, cáncer y autoinmunidad

5 Análisis básicos de tamizaje en IDP Linfocitos B Linfocitos T PMN NK

6 Citometría de Flujo-definición: Medición simultánea de múltiples características físicas de una sola célula en suspensión a una alta velocidad. Principio de las mediciones célula por célula

7 Citometría de flujo-características Una columna de líquido transporta en su seno a las células a analizar haciéndolas pasar alineadas por delante de una fuente de iluminación monocromática (generalmente un láser)

8 Una serie de detectores registran la luz dispersada por las células y su emisión de fluorescencia (luz emitida con distinta longitud de onda. Esa fluorescencia es recolectada y transformada en valores digitales almacenados en un computador.

9 Citometría de flujo-características Medianteel marcajede lascélulascon moléculas fluorescentes se pueden conocer propiedades de las mismas: expresión antigénica, fenotipificación, viabilidad, función, capacidadefectoraetc.

10 PARÁMETROS CELULARES MEDIDOS El tamaño celular relativo ( Forward Scatter o FSC) La complejidad interna o granularidad relativa (Side Scatter o SSC) Intensidades relativas de emisión de fluorescencia ( FL1, FL2, FL3,FL4..etc..) Citometría de Flujo

11 Parámetros evaluados FORWARD SCATER LUZ DIFRACTADA - S relaciona con la superficie y área celular. - Se detecta en el eje de incidencia del laser: SIDE SCATER LUZ REFLEJADA Y REFRACTADA -Se relaciona con la complejidad interna de la célula y su granularidad -Se detecta en un ángulo de 90 grados con el haz del laser. Fuente de Luz Incidente: Láser de Argón a 488 nm Detector de dispersión de luz frontal α Tamaño celular-fsc(forward Scatter) Detector de dispersión de luz en ángulo recto α Complejidad celular-ssc(side Scatter) Citometría de Flujo

12 Que podemos medir? Partículas o células en suspensióndesde 0.2 hasta 50 µm Células a partir de tejidos sólidos: disgregación y suspensión

13 Características de una célula medidas en el citómetro de flujo: Tamaño y granularidad Granulocitos Monocitos Linfocitos

14 Glóbulo rojo: 6 um Linfocito:8 um Polimorfonuclear neutrófilo= 12 um Monocito =14 um om:&imgrefurl= Tun9OM2

15 MARCACION DE CELULAS CON ANTICUERPOS FLUORESCENTES Se utilizan, generalmente, inmunoglobulinas monoclonales contra antígenos de la superficie de las células, o proteínas intraceluares marcadas con colorantes fluorescentes. Control negativo: Anticuerpo del mismo isotipomarcado con el mismo fluorocromo pero que no reconoce ninguna de las moléculas de la superficie. Control negativo: células que no fueron marcadas para determinar autofluorescencia. Control positivo: células normales, células de líneas celulares, comerciales Citometría de Flujo

16 FLUOROCROMO Sustancia que se emplea para marcar anticuerpos u otras moléculas, por su propiedad de emitir luz de una determinada longitud de onda, cuando se le estimula con un láser o con luz ultravioleta. Los fluorocromos pueden usarse directamente, aprovechando la propiedad que tienen algunos de unirse a determinadas moléculas u orgánulos tales como los colorantes de ácidos nucleicos: ioduro de propidio, bisbencimidas, etc. Pero lo más habitual es que estos colorantes se empleen conjugados a otras moléculas, como anticuerpos, que son capaces de unirse de modo específico a estructuras concretas de la célula.

17 Citometría multicolor COMO DISEÑAR UN PANEL DE FLUOROCROMOS: Selección de fluorocromos por brillo según la expresión antigénica y/o cantidad celular. (Valores Publicados) Minimizar el sobrelapamiento entre flourocromos. Usar los fluorocromos tandem( varios fluoruocromos) considerando sus limitaciones. Conocer muy bien la configuración del equipo que se esta utilizando, y manejar un muy buen control de Calidad. Luz incidente Luz transmitida

18 Fluorocromos utilizados FL1 FL2 Índice de coloración del fuorocromo y como se acopla a la molécula FL4 FL3 Luz Fluorescente emitida de menor energía y mayor longitud de onda Citometría de Flujo

19 Citometría Análoga vs Digital Análoga Se dificulta almacenar, comparar y calcular, recuperar información Menos canales de resolución No se puede modificar datos después de la adquisición Digital Más rápida, mas exacta Más canales de resolución Datos originales Se puede compensar datos después de haber realizado la adquisición de estos El proceso de compensación permite corregir el sobrelapamiento

20 Intensidad de fluorescencia y sitios de unión Número de eventos FITC FITC FITC FITC FITC FITC FITC FITC FITC FITC Intensidad de fluorescencia FITC Nivel de expresión antigénica en una célula. La expresión antigénica puede variar debido al nivel de activación celular y diferencias funcionales.

21 En linfocitos CD4 activados disminuye la intensidad de expresión del correceptor CD4. En linfocitos CD8 activados aumenta la expresión del correceptor CD8 Activación TCR modulación de CD3 La apoptosis reduce la expresión de determinados antígenos de linaje

22 Estudio de la heterogeneidad celular CD4 CD8 NK LB Mono Neu CD45 CD2 CD3 CD56,CD16 CD19 CD19,CD20 CD14 CD15 CD4 CD8 CD45RA CD45RO CD45RA CD45RO CD45RA

23 anti-cd3-fitc Linfocito T CD4 anti-il-17 RT IL-17 anti-cd4-apc anti-cd3-fitc anti-cd45-percp anti-cd8-pe Linfocito T CD8 anti-cd45-percp

24 anti-cd3-fitc Linfocito T CD3/CD8/CD4/CD45 anti-cd4-apc anti-cd8-pe anti-cd45-percp Muestra con EDTA almacenada a temperatura o Cse puede procesar en las siguientes 48 horas Cytometry, 1993;14:685-9 Cytometry, 1996;26:16-21 CDC.MMVR, 2003;52(No.RR-02):1-13.1

25 anti-cd20-fitc Linfocito B anti-cd19-pe anti-cd56-fitc anti-cd45-percp anti-cd16-pe NK anti-cd45-percp LT/LB/NK

26 Población celular Tipode antígeno Expresiónde moléculas por célula Linfocito T TCR CD CD CD CD45 > Población celular Tipode antígeno Expresiónde moléculas por célula Linfocito B CD CD NK CD Monocito CD CD

27 ANALISIS DE DATOS Los datos colectados se pueden observar de 2 maneras: 1) Histograma Eventos medidos FLUORESCENCIA

28 HISTOGRAMA Citometría de Flujo

29 Los datos colectados se pueden observar de 2 maneras: 2) Dot-plot Citometría de Flujo

30 Análisis de datos Granulocitos Linfocitos Monocitos

31 Elijo un gate: Ej. linfocitos CD3-CD4 en sangretotal CD3 CD4 en gate de linfocitos

32 Cuantificación del número de linfocitos T CD4 CD4 T cells CD 8 T Cells

33 Representación de la información J Immunol 1983;131:212

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36 Expresión de Resultados de células T maduras CD4/CD3 o CD8/CD3 Datos porcentuales Datos absolutos: Partículas de cuantificación con fluorescencia conocida células/µl Datos estadísticos Quadrant Statistics File: Normal01.05 Log Data Units: Linear Values Sample ID: Patient ID: Tube: CD3/CD8 Panel: IMK-Lymphocyte Acquisition Date: 15-Jun-95 Gate: G1 Gated Events: 2383 Total Events: 6000 X Parameter: FL1-H CD3 (Log) Y Parameter: FL2-H CD8 (Log) Quad Location: 17, 17 Quad Events % Gated % Total X Mean X Geo Mean Y Mean Y Geo Mean UL UR LL LR Citometría de Flujo

37 De que nos informan los estudios inmunfenotípicos? -Caracterización fenotípica: CD3, CD56, CD19 - Diferenciación celular: CD95, CD45RA, CD45RO - Co estimulación: CD28, ICOS, CTLA-4 - Recirculación: CD62L, CLA, α4β7 - Activación celular: CD57, CD25, HLA-DR, CD71

38 Establecer rangos propios? Parámetros que pueden afectar: género, edad del paciente, características clínicas del paciente, raza, estado de actividad física, hora del día. Subclase n Media Rango al 95 % LT CD 4 % LT CD 8 % LT totales CD3 % LT CD4 células/µl LT CD 8 células/µl LT totales células/µl National Committee for clinical laborattory Stabdars, 1992.NCCLS

39 Inmunofenotipificaciónde linfocitos apartirde sangre periférica en niños: Maduración y expansión del sistema inmune en los primeros años, la cual puede variar Objetivos: Establecer valores de referencia relativos y absolutos en diferentes etapas de la población pediátrica. Marleke, W. et Al.J Pediatr1997;130:388-93

40 Métodos: Sangre total con EDTA lisada, citometría a 2 colores Total n= 429 Neonatos (sangre de cordón umbilical) 20 Niños sanos 358 Adultos 51 1 semana a 2 meses n=13 2 a 5 meses n=46 5 a 9 meses n=105 9 a 15 meses n=70 15 a 24 meses n=33 2 a 5 años n=33 5 a 10 años n=35 10 a 16 años n=23

41 Fenotipos Linfocitos B Linfocitos T Linfocitos T CD4 Linfocitos T CD8 Linfocitos T activados Células NK CD19 CD3 CD3+/CD4+ CD3+/CD8+ CD3+/HLA DR+ CD3-/CD16+,CD56+ Seleccionaron el gatede linfocitos por tamaño y granularidad y se confirmó su pureza con marcadores CD14 y CD45 = el gatecontenía por lo menos 95% de linfocitos Valor relativo = expresado en porcentaje Valor absoluto= tomando el valor de leucocitos Estadística percentiles 5 y 95, mediana y distribución??

42 Valor relativo de subpoblaciones de linfocitos en sangre Marleke, W. et Al.J Pediatr1997;130:388-93

43 Valor absoluto de subpoblaciones de linfocitos en sangre

44 Mediana del valor absoluto de subpoblaciones de linfocitos en neonatos, niños y adultos

45 Valor absoluto de LT y subpoblaciones CD4 y CD8

46 Mediana del valor absoluto de células NK en neonatos, niños y adultos por edad

47 Conclusiones Los cambios en el valor absoluto de subpoblaciones de linfocitos no siempre son consistentes con los cambios en porcentaje. El porcentaje de LT CD3 permanece estable en un 64 al 72% desde los 2 años hasta el adulto lo cual no sucede con el valor absoluto, la mediana disminuye

48 Conclusiones El incremento en el porcentaje de células NK hasta de dos veces durante la niñez no es causada por un aumento por si de estas células, sino por la disminución en el número de LT y LB. Valores confiables en cada grupo de edades: dirigidos a estudios de inmunodeficiencias. Infección y medicamentos: periodo estable

49 Conclusiones El informe de los resultados se debe categorizar por grupos de edades. Es suficiente la evaluación de un solo marcador de linaje linfoide para LT,LB y NK?? La muestra con EDTA es estable por 2 días a T o ambiente.